利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法

摘要

本发明公开了一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，该方法是采用将香蕉胚性悬浮细胞在酶解液中进行酶解获得原生质体，受体原生质体用碘乙酰胺进行处理，供体原生质体用紫外灯进行照射处理，将供体原生质体和受体原生质体混合后，用聚乙二醇法进行融合。融合产物悬浮于原生质体液体培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基上进行培养至体胚萌发进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。本发明只有融合产物能够再生植株，减少了在培养过程中的工作量及获得苗后的筛选、鉴定的工作量；同时本发明所采用的培养基配方简单，便宜，解决了香蕉原生质体融合后融合产物培养过于繁琐的问题。

主权项

一种利用原生质体不对称融合技术获得香蕉体细胞杂种的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)香蕉原生质体的分离和纯化：将继代培养3～5d、直径200μm以下的香蕉胚性悬浮细胞与酶解液混合，所述细胞密实体积与酶解液体积比例为1∶3～5，在27±1℃、黑暗条件下，30～50rpm震荡8～10h进行酶解；将酶解后的混合物分离纯化得到香蕉受体原生质体或香蕉供体原生质体；(2)香蕉受体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉受体原生质体采用最低致死剂量的碘乙酰胺处理14～18min，将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2～3次，最后用原生质体液体培养基将处理过的原生质体稀释到浓度为105～106个/mL；香蕉供体原生质体的处理：将步骤(1)获得的香蕉供体原生质体用原生质体液体培养基稀释到浓度为105～106个/mL，然后铺成薄层，在紫外灯下照射60～180s；(3)原生质体的不对称融合：将步骤(2)处理后的受体原生质体和供体原生质体按1∶1体积比混合得到原生质体悬液；将原生质体悬液采用聚乙二醇融合法进行融合得到融合产物；(4)融合产物的看护培养：将1.2％w/v、pH 5.6～5.8的琼脂糖溶液灭菌后，温度降到30～35℃时，等体积加入到含15～20mL细胞密实体积％看护细胞的液体看护培养基中搅匀，凝固后，在其上覆盖一层消毒过的混合纤维素滤膜，将步骤(3)的融合产物转到混合纤维素滤膜上，在27±1℃、黑暗下培养，直到长出0.5～1.0mm的融合产物的细胞团；所述看护细胞为直径小于200μm的香蕉胚性悬浮细胞；其中，所述的含15～20mL细胞密实体积％看护细胞的液体看护培养基是按下述方法配制：取15～20mL香蕉胚性悬浮细胞的细胞密实体积用双倍质量浓度的看护培养基稀释到100mL；所述的看护培养基组成为：MS盐+Morel维生素+440mg L-1肌醇+2mg L-1 2，4-D+554mg L-1葡萄糖+40g L-1蔗糖+95g L-1麦芽糖，pH 5.6～5.8，过滤灭菌；(5)从融合产物获得细胞团的体胚诱导：将步骤(4)中获得的融合产物的细胞团转到体胚诱导培养基上，进行体胚诱导，得到直径为1.0～1.5mm的成熟体胚；(6)体胚的萌发与成苗：将步骤(5)中诱导得到的成熟体胚转移到体胚诱导培养基上，每隔15～20d继代一次直到体胚萌发，得到再生苗，将芽高2～3cm的再生苗进行培养，即得到体细胞杂种植株；所述的原生质体液体培养基组成为：基本培养基+1mgL-12，4-D+100mgL-1MES+72g L-1葡萄糖，过滤灭菌前pH为5.6～5.8；所述的体胚诱导培养基组成为：基本培养基+0.5mgL-1 6-BA+0.4mg L-1IAA+3g L-1Gelrite，pH为5.6～5.8，高温高压灭菌；所述基本培养基组成为：MS基本培养基+1mg L-1生物素+100mgL-1谷氨酰胺+100mg L-1麦芽提取物+45g L-1蔗糖。