自液态样品中萃取微生物之核酸之方法;A METHOD FOR EXTRACTING NUCLEIC ACIDS OF MICROORGANISMS FROM A LIQUID SAMPLE

摘要

本发明系关于一种自液态样品中萃取微生物之核酸的方法，其包括(a)将该液态样品通过滤膜，使该液态样品中之微生物附着于该滤膜之表面上；(b)将该滤膜置入溶液中；以及(c)将该溶液中之滤膜加热处理，使该微生物溶裂并使其核酸释出于该溶液中。本发明之方法可与后续的分子生物学分析方法合并使用，以检测该液态样品中之微生物。

主权项

1.一种自液态样品中萃取微生物之核酸的方法，其包括：(a)将该液态样品通过滤膜过滤，使该液态样品中之微生物附着于该滤膜之表面上；(b)将该滤膜置入溶液中；以及(c)将该溶液中之滤膜以85℃至97℃加热处理1至15分钟，使该微生物溶裂并使其核酸释出于该溶液中。 ;2.根据申请专利范围第1项之方法，其中该滤膜系氟碳微孔膜。 ;3.根据申请专利范围第1项之方法，其系进一步合并使用以该微生物之专一性引子而进行之PCR反应，以检测该样品中之微生物。 ;4.根据申请专利范围第3项之方法，其中该微生物系索氏志贺菌。 ;5.根据申请专利范围第3项之方法，其中该等引子分别具有序列编号：1及2之核苷酸序列。 ;6.根据申请专利范围第5项之方法，其中该PCR反应可产生369个硷基对之增幅产物。 ;7.根据申请专利范围第6项之方法，其中该369个硷基对可进一步经酵素切割。 ;8.根据申请专利范围第7项之方法，其中该酵素为BstEII，且该369个硷基经BstEII切割后系产生78个硷基对及291个硷基对之DNA片段。;图1显示鲍氏志贺菌，痢疾志贺菌，副痢疾志贺菌及索氏志贺菌之检体之电泳图；第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之索氏志贺菌；第3行：被稀释10 3 倍之索氏志贺菌；第4行：被稀释10 2 倍之痢疾志贺菌；第5行：被稀释10 3 倍之痢疾志贺菌；第6行：被稀释10 2 倍之副痢疾志贺菌；第7行：被稀释10 3 倍之副痢疾志贺菌；第8行：被稀释10 2 倍之鲍氏志贺菌；第9行：被稀释10 3 倍之鲍氏志贺菌；第10行：无菌水；以及第11行；100 bp标记。;图2显示大肠杆菌W3110 (ATCC 27325)，猪伤寒沙门菌(Sallmonella choleraesuis)(ATCC 13311)，肺炎克雷白氏菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC 13883)，黏质沙雷菌(Serratia marcescens)(ATCC 13880)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(ATCC 13048)及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(ATCC 13047)之检体之电泳图；第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之肺炎克雷白氏菌；第3行：被稀释10 3 倍之肺炎克雷白氏菌；第4行：被稀释10 2 倍之猪伤寒沙门菌；第5行：被稀释10 3 倍之猪伤寒沙门菌；第6行：被稀释10 2 倍之黏质沙雷菌；第7行：被稀释10 3 倍之黏质沙雷菌；第8行：被稀释10 2 倍之阴沟肠杆菌；第9行：被稀释10 3 倍之阴沟肠杆菌；第10行：被稀释10 2 倍之产气肠杆菌；第11行：被稀释10 3 倍之产气肠杆菌；第12行：被稀释10 2 倍之大肠菌W3110；第13行：被稀释10 3 倍之大肠菌W3110；第14行：被稀释10 2 倍之副痢疾志贺菌；第15行：无菌水；以及第16行；100 bp标记。;图3显示得自井水及于25℃培育之检体之电泳图；第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之P. syclowiorum；第3行：被稀释10 3 倍之P. syclowiorum；第4行：被稀释10 2 倍之产气味沙雷菌(S. odorifera)；第5行：被稀释10 3 倍之产气味沙雷菌；第6行：被稀释10 2 倍之P. agglomerans；第7行：被稀释10 3 倍之P. agglomerans；第8行：被稀释10 2 倍之赫氏埃希氏菌(E. hermanii)；第9行：被稀释10 3 倍之赫氏埃希氏菌(E. hermanii)；第10行：被稀释10 2 倍之乙酸钙/包氏/基因型2不动杆菌(A. calcoacet/baumannii/gen 2)；第11行：被稀释10 3 倍之乙酸钙/包氏/基因型2不动杆菌；第12行：被稀释10 2 倍之黏质沙雷菌；第13行：被稀释10 3 倍之黏质沙雷菌；第14行：无菌水；第15行；100 bp标记。;图4显示得自井水及于20℃培育之检体之电泳图；第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之强生不动杆菌(A. johnsonii)；第3行：被稀释10 3 倍之强生不动杆菌；第4行：被稀释10 2 倍之头皮葡萄球菌(S. capitis)；第5行：被稀释10 3 倍之头皮葡萄球菌(S. capitis)；第6行：水：第7行：索氏志贺菌以及第8行；100 bp标记。;图5显示单离自地下水及于25℃培育之检体之电泳图；(A)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之尿素分解性/尿道欧立吉菌(Oligella ureolytica/urethralis)；第3行：被稀释10 3 倍之尿素分解性/尿道欧立吉菌；第4行：被稀释10 2 倍之嗜麦芽糖黄单胞菌(X. maltophilia)；第5行：被稀释10 3 倍之嗜麦芽糖黄单胞菌；第6行：被稀释10 2 倍但无法被监别出之菌株；第7行：被稀释10 3 倍但无法被监别之菌株；第8行：无菌水；第9行：被稀释10 2 倍之索氏志贺菌以及第10行：100 bp标记；(B)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 2 倍之德氏嗜酸菌(A. delafieldii)；第3行：被稀释10 3 倍之德氏嗜酸菌；第4行：被稀释10 2 倍但无法被监别出之菌株-1；第5行：被稀释10 3 倍但无法被监别出之菌株-1；第6行：被稀释10 2 倍之嗜麦芽糖黄单胞菌(X. maltophilia)；第7行：被稀释10 3 倍之嗜麦芽糖黄单胞菌；第8行：被稀释10 2 倍之基因型15不动杆菌(A. genospecies 15)；第9行：被稀释10 3 倍之基因型15不动杆菌；第10行：被稀释10 2 倍但无法被监别出之菌株-2；第11行：被稀释10 3 倍但无法被监别出之菌株-2；第12行：索氏志贺菌；第13行：无菌水以及第14行：100 bp标记。;图6显示被一系列10倍稀释之索氏志贺菌(ATCC 29930)之电泳图；第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10倍；第3行：被稀释10 2 倍；第4行：被稀释10 3 倍；第5行：被稀释10 4 倍；第6行：被稀释10 5 倍；第7行：被稀释10 6 倍；第8行：被稀释10 7 倍；第9行：被稀释10 8 倍；第10行：被稀释10 9 倍；第11行：被稀释10 10 倍；第12行：被稀释10 11 倍；第13行：无菌水；第14行：100 bp标记。;图7显示鲍氏志贺菌(ATCC 8700)，痢疾志贺菌(ATCC 4837)，副痢疾志贺菌(ATCC 29903)，索氏志贺菌(ATCC 29930)，大肠杆菌W3110 (ATCC 27325)，产气肠杆菌(ATCC 13048)，产气味沙雷菌，P. agglomerans及黏质沙雷菌之369 bp PCR产物之BstEII切割片段；奇数行代表未被BstEII切割之PCR产物以及偶数行代表被BstEII切割之PCR产物；(A)M行：100 bp标记；第1及2行：索氏志贺菌(ATCC 29930)；第3及4行：副痢疾志贺菌(ATCC 29903)；第5及6行：鲍氏志贺菌(ATCC 8700)；第7及8行：痢疾志贺菌(ATCC 4837)；第9及10行：产气肠杆菌(ATCC 13048)；第11及12行：大肠杆菌W3110 (ATCC 27325)；第13及14行：产气味沙雷菌；(B)第1及2行：乙酸钙/包氏/基因型2不动杆菌；以及第3及4行：黏质沙雷菌。;图8显示索氏志贺菌ATCC 9290、ATCC 11060、ATCC 25931、ATCC 20920及ATCC 29031之检体之电泳图；(a)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 7 倍之索氏志贺菌ATCC 9290；第3行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌ATCC 9290；第4行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌ATCC 9290；第5行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌ATCC 9290；第6行：被稀释10 11 倍之索氏志贺菌ATCC 9290；第7行：被稀释10 7 倍之索氏志贺菌ATCC 11060；第8行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌ATCC 11060；第9行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌ATCC 11060；第10行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌ATCC 11060；第11行：被稀释10 11 倍之索氏志贺菌ATCC 11060；第12行：无菌水；第13行；索氏志贺菌；第14行：100 bp标记；(b)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌ATCC 25931；第3行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌ATCC 25931；第4行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌ATCC 25931；第5行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌ATCC 20920；第6行：被稀释10 7 倍之索氏志贺菌ATCC 20920；第7行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌ATCC 20920；第8行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌ATCC 20920；第9行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌ATCC 20920；第10行：无菌水；第11行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌ATCC 29031；第12行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌ATCC 29031；第13行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌ATCC 29031；第14行：无菌水；第15行；索氏志贺菌；第16行：100 bp标记。;图9显示索氏志贺菌SH 7105、SH 8255、SH 9397、SH 8069、SH 10567、south 27及south 36被一系列10倍稀释之检体之电泳图；(a)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌(ATCC 29930)；第3行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(SH 7105)；第4行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(SH 7105)；第5行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(SH 7105)；第6行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(SH 8255)；第7行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(SH 8255)；第8行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(SH 8255)；第9行：无菌水；第10行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(SH 9397)；第11行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(SH 9397)；第12行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(SH 9397)；第13行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(SH 8069)；第14行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(SH 8069)；第15行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(SH 8069)；第16行：无菌水；第17行：100 bp标记；(b)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 7 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第3行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第4行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第5行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第6行：被稀释10 11 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第7行：被稀释10 12 倍之索氏志贺菌(SH 10567)；第8行：无菌水；第9行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌(ATCC 29930)；第10行：100 bp标记；(c)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌(south27)；第3行：被稀释10 7 倍之索氏志贺菌(south 27)；第4行：被稀释10 8 倍之索氏志贺菌(south 27)；第5行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(south 27)；第6行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(south 27)；第7行：被稀释10 11 倍之索氏志贺菌(south 27)；第8行：无菌水；第9行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌(ATCC 29930)；第10行：100 bp标记；(d)第1行：100 bp标记；第2行：被稀释10 9 倍之索氏志贺菌(south 36)；第3行：被稀释10 10 倍之索氏志贺菌(south 36)；第4行：被稀释10 11 倍之索氏志贺菌(south 36)；第5行：无菌水；第6行：被稀释10 6 倍之索氏志贺菌(ATCC 29930)；第7行：100 bp标记。;图10显示索氏志贺菌之369 bp产物之被BstEII切割之片段之电泳图，奇数行代表不会被BstEII切割之PCR产物以及偶数行代表会被BstEII切割之PCR产物；(A)M行：100 bp标记；第1及2行：索氏志贺菌(ATCC 11060)；第3及4行：索氏志贺菌(ATCC 25931)；第5及6行：索氏志贺菌(ATCC 20920)；第7及8行：索氏志贺菌(ATCC 29031)；第9及10行：索氏志贺菌(south 27);(B)M行：100 bp标记；第1及2行：索氏志贺菌(south 36)；第3及4行：索氏志贺菌(SH 10567)；第5及6行：索氏志贺菌(SH 7105)；第7及8行：索氏志贺菌(SH 8255)；第9及10行：索氏志贺菌(SH 9397)；第11及12行：索氏志贺菌(SH 8069)；以及第13及14行：索氏志贺菌(ATCC 9290)。