合成可在宿主-载体表现系统中有效表现之目标聚核苷酸之方法;METHOD OF SYNTHESIZING A TARGET POLYNUCLEOTIDE EFFICIENTLY EXPRESSED IN A HOST-VECTOR EXPRESSION SYSTEM

摘要

本发明提供一种合成可在宿主-载体表现系统中有效表现之目标聚核苷酸之方法，其系使用一种引子延伸技术，以构成该目标聚核苷酸序列。较佳者，该方法系应用于一种在宿主中高度表现由该目标聚核苷酸编码之目标异源多肽之方法。

主权项

1.一种合成编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸之方法，其包含步骤：(1)在第一模板上，以第一引子对，进行第一聚合酶连锁反应，以取得第一聚合酶连锁反应产物；其特征在于，该第一模板系常用于该宿主-载体表现系统中之任何模板序列或系该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸之片段；(2)以引子延伸技术，进行多次循环之聚合酶连锁反应，以取得包含该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列之产物；其中在各聚合酶连锁反应中所使用之模板系取自前一聚合酶连锁反应之产物；且其特征在于，用于该等聚合酶连锁反应中之引子对系经设计为下列三种引子对中之任何一种，且各引子对之引子为小于36个核苷酸之寡核苷酸：(i)该正向引子具有两个部分：(a)(a1)部分，位于该正向引子之5'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与位于该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列3'-端区域之片段同源，及(b)(b1)部分，位于该正向引子之3'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与该模板序列5'-端区域超过10个核苷酸之序列同源；且其中该(a1)部分之3'-端毗邻该(b1)部分之5'-端；且该反向引子在该反向引子之3'-端区域具有一片段，具有超过5个核苷酸，并可与该模板序列之3'-端区域黏连；(ii)该正向引子在该正向引子之3'-端区域具有一具有超过5个核苷酸之片段，并与该模板序列之5'-端区域同源；且该反向引子具有(a)(a2)部分，位于该反向引子之5'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列之5'-端区域序列互补；(b)(b2)部分，位于该反向引子之3'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并可与该模板序列3'-端区域超过10个核苷酸之序列黏连；且其中该(a2)部分之3'-端毗邻该(b2)部分之5'-端；以及(iii)该正向引子具有(a)(a3)部分，位于该正向引子之5'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与位于该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列3'-端区域之片段同源；(b)(b3)部分，位于该正向引子之3'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与该模板序列5'-端区域超过10个核苷酸之序列同源；且其中该(a3)部分之3'-端毗邻该(b3)部分之5'-端；且该反向引子具有(c)(c3)部分，位于该反向引子之5'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并与该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列之5'-端区域互补；(d)(d3)部分，位于该反向引子之3'-端区域，其包含一具有超过10个核苷酸之片段，并可与该模板序列3'-端区域超过10个核苷酸之序列黏连；且其中该(c3)部分之3'-端毗邻该(d3)部分之5'-端；且其中所有用于该等聚合酶连锁反应中之编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列片段顺序构成该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列；及(3)自该等多循环性聚合酶连锁反应之终产物，取得包含该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列之聚核苷酸产物；其中该病毒系选自由猪生殖及呼吸症候群病毒及口蹄疫病毒所组成之群。 ;2.根据申请专利范围第1项之方法，如该第一模板与该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸并不相关时，其另包含自该步骤(3)之终产物除去该第一模板核苷酸序列之步骤，以取得该目标聚核苷酸序列。 ;3.根据申请专利范围第2项之方法，其中该第一模板系经设计，以在其两端具有限制酶辨识位点。 ;4.根据申请专利范围第1项之方法，其中该用于各步骤中之具有超过10个核苷酸之片段系超过15个核苷酸。 ;5.根据申请专利范围第1项之方法，其中如该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸序列与该宿主系异源性者，可将该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸中之部分密码子改变成为可在该宿主细胞中以高表现效率转译相同胺基酸之密码子。 ;6.根据申请专利范围第1项之方法，其中该宿主系肠细菌。 ;7.根据申请专利范围第1项之方法，其中该病毒系为猪生殖及呼吸症候群病毒，且该病毒蛋白质系为PRRSV-ORF7。 ;8.根据申请专利范围第7项之方法，其中该第一模板系为猪生殖及呼吸症候群病毒之基因组。 ;9.根据申请专利范围第7项之方法，其中编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸具有如序列辨识编号1所示之序列。 ;10.根据申请专利范围第7项之方法，其中该第一引子对包含一正向引子及一反向引子；其中该正向引子具有如序列辨识编号2所示之序列；该反向引子具有如序列辨识编号5所示之序列。 ;11.根据申请专利范围第7项之方法，其中该第一引子对包含一正向引子及一反向引子；其中该正向引子具有如序到辨识编号2所示之序列；该反向引子具有如序列辨识编号3所示之序列。 ;12.根据申请专利范围第7项之方法，其中步骤(2)系包含由一第二引子对所进行之聚合酶连锁反应；其中该第二引子对包含一正向引子及一反向引子，其中该正向引子具有如序列辨识编号2所示之序列；该反向引子具有如序列辨识编号6所示之序列。 ;13.根据申请专利范围第1项之方法，其中步骤(2)系包含由一第三引子对所进行之聚合酶连锁反应；其中该第三引子对包含一正向引子及一反向引子，其中该正向引子具有如序列辨识编号2所示之序列；该反向引子具有如序列辨识编号7所示之序列。 ;14.根据申请专利范围第1项之方法，其中该病毒系为口蹄疫病毒，且该病毒蛋白质系为FMD-vpg。 ;15.根据申请专利范围第14项之方法，其中该第一模板系为口蹄疫病毒之基因组。 ;16.根据申请专利范围第14项之方法，其中编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸具有如序列辨识编号8所示之序到。 ;17.根据申请专利范围第14项之方法，其中该第一引子对包含一正向引子及一反向引子；其中该正向引子具有如序列辨识编号10所示之序列；该反向引子具有如序到辨识编号11所示之序列。 ;18.根据申请专利范围第14项之方法，其中步骤(2)系包含由一第二引子对所进行之聚合酶连锁反应；其中该第二引子对包含一正向引子及一反向引子，其中该正向引子具有如序列辨识编号12所示之序列；该反向引子具有如序列辨识编号11所示之序列。 ;19.根据申请专利范围第14项之方法，其中步骤(2)之正向引子具有选自由序列辨识编号13至20所组成之群之序列。 ;20.一种在宿主中高度表现病毒蛋白质之方法，其包含步骤：(1)提供一种编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸，其系由根据申请专利范围第1至19项中任一项之方法取得；(2)以该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸对该宿主进行转形或转染；及(3)在该经转形或转染之宿主中表现该病毒蛋白质；其中该病毒系选自由猪生殖及呼吸症候群病毒及口蹄疫病毒所组成之群。 ;21.根据申请专利范围第20项之方法，其中该宿主系肠细菌。 ;22.根据申请专利范围第21项之方法，其尚包含在用以表现该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸片段中，将编码白胺酸之密码子CTA变更为CTG、CTT、CTC、TTG、或TTA；将编码异白胺酸之密码子ATA变更为ATC或ATT；将编码精胺酸之密码子CGG、AGG、AGA变更为CGT或CGC；将编码甘胺酸之密码子GGA变更为GGT或GGC；将编码脯胺酸之密码子CCC变更为CCG、CCA、或CCT；将编码白胺酸之密码子CTA变更为CTG、CTT、CTC、TTG、或TTA；将编码异白胺酸之密码子ATA变更为ATC或ATT；将编码精胺酸之密码子CGG、AGG、AGA变更为CGT或CGC；将编码甘胺酸之密码子GGA变更为GGT或GGC；并将编码脯胺酸之密码子CCC变更为CCG、CCA、或CCT。 ;23.根据申请专利范围第20项之方法，其中该病毒系为猪生殖及呼吸症候群病毒，且该病毒蛋白质系为PRRSV-ORF7。 ;24.根据申请专利范围第20项之方法，其中该病毒系为口蹄疫病毒，且该病毒蛋白质系为FMD-vpg。 ;25.根据申请专利范围第1项之方法，其中该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸系编码一突变蛋白，其具有相较于其野生型之多重突变位点。 ;26.根据申请专利范围第1项之方法，其中该步骤(1)之第一聚合酶连锁反应进一步由一协助引子进行，其系与该第一引子对中之一引子同源者，且其与该编码可在宿主-载体表现系统中有效表现病毒蛋白质之聚核苷酸一股中之一片段相同。 ;27.根据申请专例范围第16项之方法，其中该病毒系为猪生殖及呼吸症候群病毒，该病毒蛋白质系为PRRSV-ORF7；且该协助引子具有如序列辨识编号4所示之序列。;图1说明根据本发明一具体实例之合成目标聚核苷酸方法之流程图。;图2说明根据本发明另一具体实例之合成目标聚核苷酸方法之流程图。;图3说明在根据本发明之实例1而合成该第一模板时，对该聚合酶连锁反应之产物进行琼脂凝胶电泳之结果。;图4说明在根据本发明之实例1而合成包含该目标聚核苷酸序列之聚核苷酸产物时，对该聚合酶连锁反应之产物进行琼脂凝胶电泳之结果。;图5说明本发明实例1之流程图。;图6说明根据本发明实例1之PRRSV-ORF7蛋白表现载体建构。;图3说明以SDS-PAGE显示根据本发明实例3之FMD-vpg蛋白在改变密码子后之表现结果。