测定对人BAFF-R基因启动子活性影响因素的方法

摘要

本发明公开了一种测定对人BAFF-R基因启动子活性影响因素的方法，包括引物设计、BAFF-R基因5’侧翼区的克隆、BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建、细胞培养、IFN-γ和NF-κB抑制剂对细胞增殖的干预、重组体转染、荧光素酶活性检测、IFN-γ和NF-κB抑制剂对BAFF-R启动子活性和mRNA表达的干预等步骤。本发明方法可靠、易操作，为进一步研究BAFF-R的调节机制提供了基本的依据。

主权项

1.一种测定对人BAFF-R基因启动子活性影响因素的方法，其特征是：包括下列步骤：(1)引物设计：用引物设计软件按叠瓦方式在BAFF-R基因5’侧翼序列设计八个片段的引物，八对引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性内切酶HindIII位点，5’端加限制性内切酶Mlu I位点，同时在两端分别添加6个保护碱基，便于酶切插入到载体的多克隆位点；八个片段的引物序列及下游引物序列为：其中1-8为八个不同长度片段的上游引物序列，9为八个片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作为扩增相应产物B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8的引物，B1～B8分别与上述引物1～8对应；(2)BAFF-R基因5’侧翼区的克隆：从人全血中提取基因组DNA作为模板，应用LATaq酶PCR扩增目的片度B8；用限制性内切酶Mlu I、Hind III酶切胶回收纯化后的PCR扩增产物B8及pGL3-Basic载体，酶切产物经T₄连接酶连接，连接混合产物转化大肠埃希菌DH5α，酶切测序鉴定阳性克隆，得到阳性重组质粒，命名为pGL3-B8；(3)BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建：以重组质粒pGL3-B8为模板，PCR扩增目的片段B1-B7，同构建重组质粒pGL3-B8的方法一样，得到7个重组体，分别命名为pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7；(4)细胞培养：人多发性骨髓瘤细胞株KM3悬浮生长于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于5％CO₂，37℃恒温培养，1～2d传代一次；(5)IFN-γ和NF-κB抑制剂对细胞增殖的干预：将传代培养的KM3细胞调整浓度为2×10⁹/L，每孔100μL接种于96孔培养板中，培养过夜后，分别用不同浓度的IFN-γ和BAY11-7082进行干预，每种浓度重复3孔，再培养24h后加入WST试剂10μL，1h后测定各孔的A450值；(6)重组体转染：KM3细胞分为11组：(1)pGL3-B 1组；(2)pGL3-B2组；(3)pGL3-B3组；(4)pGL3-B4组；(5)pGL3-B5组；(6)pGL3-B6组；(7)pGL3-B7组；(8)pGL3-B8组；(9)pGL3-Control组；(10)pGL3-Basic组；(11)无质粒空白对照组，各组均以psv-β-gal质粒作为内参照，将构建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八种重组质粒以及阴性对照pGL3-Basic，阳性对照pGL3-Control，分别转染KM3细胞，同时共转染psv-β-gal内参质粒，空白对照组不转染任何质粒；(7)对步骤(6)中的各组，转染48h后各组分别收集并裂解细胞，进行荧光素酶活性检测；(8)IFN-γ和NF-κB抑制剂对BAFF-R启动子活性和mRNA表达的干预：重复步骤(6)，并对步骤(6)中的各组重组质粒转染24h后在细胞培养液中加入IFN-γ和BAY11-7082，继续培养细胞24h后，各组分别收集并裂解细胞，检测荧光素酶的相对活性及RT-PCR方法检测BAFF-R mRNA的表达水平。