齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法

摘要

本发明公开了一种齿兰环斑病毒(Odontoglossum Ringspot Virus，ORSV)外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法。利用原核表达系统表达齿兰环斑病毒的外壳蛋白，用原核表达的齿兰环斑病毒外壳蛋白免疫兔子、BALB/C鼠制备其多抗血清，利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体，并用制备的抗体建立了检测ORSV高度特异性、灵敏性和正确性的的免疫捕获RT-PCR及ELISA方法。为该病毒病的诊断、抗病育种和脱毒苗的培育提供技术支持。本发明提供的齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法为兰环斑病毒的快速检测诊断、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该兰花病毒病的防治打下基础。

主权项

一种齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达方法，其特征在于包括如下步骤：1)根据GenBank中的编码ORSV外壳蛋白基因的全长序列No.EU683879设计引物，上游引物为CGGGATCCATGTCTTACACTATTAC，下游引物为CGGTCGACTTAGGAAGAGGTCCAAGTA；2)利用Trizol试剂提取齿兰环斑病毒兰花病叶的总RNA；3)RT-PCR克隆ORSV外壳蛋白基因：用下游引物按照RevertAidTM逆转录试剂盒合成ORSV外壳蛋白基因第一链cDNA进行，利用上述设计的一对引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，克隆ORSV外壳蛋白基因；4)ORSV外壳蛋白基因按正确的读码框插入到原核表达载体pET-32a中，构建成重组原核表达载体pET-32a-CP；5)将重组载体pET-32a-CP转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株；6)用IPTG诱导表达4-6h，离心收集菌体，菌体经超声波破碎，收集上清用Ni+NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。