一种高效快速的甘蔗转基因方法

摘要

本发明属于植物生物技术领域，具体是一种高效快速的甘蔗转基因方法，其是以甘蔗的幼叶组织作为外植体诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织作为农杆菌侵染的受体材料，通过先分化培养成胚状体、小芽和小苗后再进行抗性转化，获得抗性转化植株，然后提取抗性植株的DNA、RNA，进行PCR、RT-PCR检测，经PCR、RT-PCR检测为阳性的植株再移栽到大棚，待长大后再进行其它一些分子与生理生化的检测。本发明可大幅度提高转化效率，缩短转化的时间，只需4个月就可得到PCR、RT-PCR检测为阳性的转基因植株，节约转化成本，因先进行PCR、RT-PCR检测后才移栽，减少了大量假抗性苗的移栽和管理，也降低了实验成本。

主权项

一种高效快速的甘蔗转基因方法，其特征在于：包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程、胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程、转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程；1)、甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程：以优良甘蔗栽培种的顶端生长点处的幼叶组织为外植体，外植体经消毒、无菌水冲洗、无菌滤纸吸干其表面的水分后切成薄片接种于诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出胚性愈伤组织；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1-2mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶；2)、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程：将含有目的基因的农杆菌EHA105单菌落接种到活化培养基中震荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积vir基因诱导培养基中继续震荡培养，以诱导农杆菌质粒vir基因的表达，此菌液即为转化用的农杆菌工程菌液；将甘蔗胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，浸泡后再接种于共培养培养基上于黑暗条件下共培养，然后接种于分化培养基上；所述活化培养基是以YEP为基础培养基，并添加相应抗生素Kan 50μg/mL，Str50μg/mL，Rif 50μg/mL；所述vir基因诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮；所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮、卡拉胶20g/L；所述分化培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1mg/L6-BA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶；3)、胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程：将接种于分化培养基上的胚性愈伤组织置于1500lux，14h/d光照条件下培养至胚状体形成，然后将胚状体更换到生芽培养基上，继续置于1500lux，14h/d光照条件下培养产生小芽，然后将小芽转接到成苗培养基上，1500lux，14h/d光照条件下培养至长成小苗，将长成0.5cm-3cm的小苗转接到抗性培养基上于1500lux，14h/d光照条件下培养18-25天获得抗性植株，将抗性植株单株单瓶按编号培养于壮苗生根培养基上进行抗性植株的生根壮苗培养18-25天；所述生芽培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶；所述成苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶；所述抗性培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶；所述壮苗生根培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶、50-100ml/L椰子汁；4)、转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程：按编号剪取单株单瓶培养于壮苗生根培养基上的抗性植株的叶片，剪碎后置于液氮中冷冻3-8秒，研碎，用CTAB法提取DNA，然后进行PCR检测；经PCR检测为阳性的植株用同样的方法提取RNA进行RT-PCR检测；最后将PCR及RT-PCR检测均呈阳性的植株从培养基中取出洗净炼苗后移栽到大棚。