主权项 |
一种猪产仔数性状的分子标记方法,其特征在于包括以下操作步骤:(1)采集耳组织样在仔猪出生当天,采取猪的耳缘组织;(2)基因组DNA提取从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA;(3)引物设计在猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子两端设计1对引物,即上游引物和下游引物,其序列如下:上游引物:TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC,下游引物:GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT;(4)聚合酶链式反应A、配制聚合酶链式反应体系由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、浓度为50ng/ul猪的DNA基因组溶液2ul、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5ul,加水17.1ul至终体积25ul;并混合均匀,制得25ul聚合酶链式反应体系;B、聚合酶链式反应条件将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器,反应条件如下:①94℃预变性4分钟,②94℃变性30秒,③退火温度63℃30秒,④72℃延伸30秒,⑤重复第②~④步骤35个循环,⑥72℃延伸7分钟,最后降温至4℃保存,得到猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物;(5)限制性内切酶酶切反应,多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测由于猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子第17位碱基由A突变为G,导致了一个Aval限制性内切酶的酶切多态性位点,具体酶切反应操作步骤是:取猪性激素结合球蛋白(SHBG)基因第6外显子的体外扩增产物10ul于聚合酶链式反应(PCR)管中,分别加入10U/ul Aval限制性内切酶1ul,Aval限制性内切酶缓冲液2ul,加水7ul,混匀,温度37℃反应3小时,得到酶切产物;将酶切产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时,电泳条件:常温,电压120V,得到含酶切产物的凝胶;将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型,GG型个体为产仔数性状优良基因类型,选择其中条带为GG型的个体留种,可提高选留群体的产仔数。 |