快速核酸印渍分析方法

摘要

本发明系关于一种快速之核酸印渍(blot)分析方法，其系先将一待分析核酸传递于一基质上，并使该待分析核酸固定于该基质上，之后省略一般所需前杂交反应(prehybridization)之阻断(blocking)步骤，于不将该基质上未固定有该待分析核酸区域加以阻断之情况下，直接加入探针(probe)核酸进行短时间的杂交反应，最后再进行清洗步骤，将未与该待分析核酸相结合的该探针核酸分离去除，并于后续之杂交讯号检测步骤中获致检测结果。藉由本发明中前杂交等反应之省略与相对应缩短时程之杂交反应与清洗反应，即可大幅缩短核酸杂交所需之反应时间，而快速地完成整个核酸印渍分析过程。

主权项

1.一种省略阻断(blocking)步骤之快速核酸印渍分析方法，系由下列步骤组成：(1)提供一基质，该基质系具有孔洞；(2)在无需将该基质进行预先湿润之条件下，将一未进行预先变性之待分析核酸传递至该基质上，并使该待分析核酸为该基质所吸附；(3)藉由烘乾或紫外光照射将该待分析核酸固定于该基质上；(4)在该基质呈乾燥之状态且于不将该基质上未固定有该待分析核酸区域加以阻断之情况下，将一含有探针(probe)核酸之溶液加入步骤(3)的该基质上，使该探针核酸与该基质上之该待分析核酸进行硷基配对(base pairing)，并使配对反应时间缩短为5分钟以内；(5)将经步骤(4)之该基质，以一缓冲溶液漂洗3至6分钟，藉以将未与该待分析核酸相结合的该探针核酸分离去除；以及(6)检测经步骤(5)之该基质上的杂交讯息。 ;2.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(1)中之该基质系呈乾燥状。 ;3.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(1)中之该基质系一薄膜(membrane)。 ;4.如申请专利范围第3项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质系一尼龙膜(nylon membrane)。 ;5.如申请专利范围第3项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质系一硝化纤维纸(nitrocellulose mem brane)。 ;6.如申请专利范围第1、3、4或5项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质之孔洞直径系0.1至50 μm。 ;7.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(2)中之该待分析核酸系去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid)。 ;8.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(2)中之该待分析核酸系核醣核酸(ribonucleic acid)。 ;9.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质置于80℃至130℃之温度下进行烘乾。 ;10.如申请专利范围第9项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)之烘乾时间系1至10分钟。 ;11.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质以紫外光照射5至10分钟。 ;12.如申请专利范围第11项所述之快速核酸印渍分析方法，于步骤(3)之后进一步使固定有该待分析核酸之该基质呈乾燥状。 ;13.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(4)之该硷基配对反应时间系2至5分钟。 ;14.如申请专利范围第1项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系包括0.05至0.15倍之标准柠檬酸钠溶液(standard sodium citrate，SSC)。 ;15.如申请专利范围第14项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系进一步包括0.05%至0.15%(w/v)之硫酸十二酯钠溶液(sodium dodecyl sulfate，SDS)。 ;16.一种快速核酸印渍分析方法，系由下列步骤组成：(1)提供一基质，该基质系具有孔洞并呈乾燥状；(2)在无需将该基质进行预先湿润之条件下，将一未进行预先变性之探针核酸传递至该基质上，使该探针核酸为该基质所吸附；(3)藉由烘乾或紫外光照射将该探针核酸固定于该基质上；(4)在该基质呈乾燥之状态且不将该基质上未固定有该待分析核酸区域加以阻断之情况下，将一含有待分析核酸之溶液加入步骤(3)的该基质上，使该探针核酸与该待分析核酸进行硷基配对，并使配对反应时间缩短为5分钟以内；(5)将经步骤(4)之该基质，以一缓冲溶液漂洗3至6分钟，藉以将未与该探针核酸相结合的该待分析核酸分离去除；以及(6)检测经步骤(5)之该基质上的杂交讯息。 ;17.如申请专利范围第16项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质系一薄膜。 ;18.如申请专利范围第17项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该薄膜系一尼龙膜。 ;19.如申请专利范围第17项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(1)中之该薄膜系一硝化纤维纸。 ;20.如申请专利范围第16、17、18或19项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质之孔洞直径系0.1至50 μm。 ;21.如申请专利范围第16项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质置于80℃至130℃下，烘乾1至10分钟。 ;22.如申请专利范围第16项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质以紫外光照射5至10分钟。 ;23.如申请专利范围第22项所述之快速核酸印渍分析方法，于步骤(3)之后进一步使固定有该探针核酸之该基质呈乾燥状。 ;24.如申请专利范围第16项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(4)之该硷基配对反应时间系2至5分钟。 ;25.如申请专利范围第16项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系包括0.05至0.15倍标准柠檬酸钠溶液。 ;26.如申请专利范围第25项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系进一步包括0.05%至0.15%(w/v)硫酸十二酯钠溶液。 ;27.一种快速核酸印渍分析方法，系由下列步骤组成：(1)提供一基质，该基质系具有孔洞；(2)在无需将该基质进行预先湿润之条件下，将一未进行预先变性之待分析核酸传递至该基质上，并使该待分析核酸为该基质所吸附；(3)藉由烘乾或紫外光照射将该待分析核酸固定于该基质上；(4)在该基质呈乾燥之状态且不将该基质上未固定有该待分析核酸区域加以阻断之情况下，以抽真空所形成之负压将一含有探针核酸之溶液加入步骤(3)的该基质上，使该探针核酸迅速进入该基质内部，并与该基质上之该待分析核酸进行硷基配对，并使配对反应时间缩短为5分钟以内；(5)将经步骤(4)之该基质，以一缓冲溶液漂洗3至6分钟，藉以将未与该待分析核酸相结合的该探针核酸分离去除；以及(6)检测经步骤(5)之该基质上的杂交讯息。 ;28.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(4)中之该探针核酸系于该基质上相对于探针核酸所在之另面上抽以真空，利用该真空所形成之负压使该探针核酸进入该基质内部。 ;29.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(4)中之该探针核酸系于该基质所连接之一流道内，以加压方式进入该基质内部。 ;30.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(1)中之该基质系呈乾燥状。 ;31.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(1)中之该基质系一薄膜。 ;32.如申请专利范围第31项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质系一尼龙膜。 ;33.如申请专利范围第31项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质系一硝化纤维纸。 ;34.如申请专利范围第27、31、32或33项所述之快速核酸印渍分析方法，其中该基质之孔洞直径系0.1至50 μm。 ;35.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(2)中之该待分析核酸系去氧核醣核酸。 ;36.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(2)中之该待分析核酸系核醣核酸。 ;37.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质置于80℃至130℃之温度下进行烘乾。 ;38.如申请专利范围第37项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)之烘乾时间系1至10分钟。 ;39.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(3)系将该基质以紫外光照射5至10分钟。 ;40.如申请专利范围第39项所述之快速核酸印渍分析方法，于步骤(3)之后进一步使固定有该待分析核酸之该基质呈乾燥状。 ;41.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(4)之该硷基配对反应时间系2至5分钟。 ;42.如申请专利范围第27项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系包括0.05至0.15倍之标准柠檬酸钠溶液。 ;43.如申请专利范围第42项所述之快速核酸印渍分析方法，其中步骤(5)中该缓冲溶液系进一步包括0.05%至0.15%(w/v)之硫酸十二酯钠溶液。;第一图系习知核酸印渍分析方法之流程示意图。;第二图系本发明实施例之流程示意图。;第三图系本发明第二实施例之流程示意图。;第四图系本发明以不同时间进行核酸固定之比较结果图。图中，横座标系烘乾固定时间，纵座标系萤光讯号强度。;第五图系本发明以不同时间进行硷基配对之比较结果图。图中，横座标系硷基配对之反应时间，纵座标系萤光讯号强度。;第六图系以微流体晶片进行本发明核酸印渍分析方法之杂交结果图。图中，横座标系漂洗次数，纵座标系萤光讯号强度。◆：E.coli DNA；■：控制组；●：E.tarda DNA。