一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法

摘要

本发明涉及一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法，步骤如下：解剖动物获取原代细胞，将转瓶所需细胞量的1/2或1/3细胞接种于多层细胞培养瓶内，加入适量培养液放入温房培养，待长满单层后接种病毒培养、收获病毒培养液、纯化后配制疫苗。使用多层细胞瓶的优点是：接种原代细胞量少、培养出的细胞量多、占用空间小、不需要转瓶机、收率高。

主权项

一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法，其特征在于：步骤如下：(1)、选用10-20日龄的清洁级沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用含3-5％的小牛血清MEM培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装多层细胞培养瓶，每瓶8000ml，置37±1℃培养2-3天后更换含1％的小牛血清MEM培养液；(2)、待4-5天细胞长满致密单层后，按0.2MOI接种病毒，每100cm2的细胞接种1ml滴度为6.0lgCCID50/ml的出血热病毒工作种子；置34.5±1℃培养22-26小时，弃去瓶中培养液，每瓶用pH7.2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的维持液继续培养；(3)、5-6天后，进行第一次病毒收获，收获前从培养瓶内刮取少量细胞，用特异性单克隆荧光抗体检查细胞的病毒感染率及病毒型别，感染率应在95％以上；每次收获后加入新鲜维持液继续培养，每个40层细胞工厂8000ml，每隔72±4小时收获一次，收获4-5次；(4)、单次病毒收获液以15000r/min连续流离心，流速为2500ml/min，收集上清，上清液按1∶4000的比例加入β-丙内酯置2-8℃3天灭活，灭活到期后，每个病毒灭活容器立即取样分别进行病毒灭活验证试验；待灭活验证试验合格后合并为单价病毒收获液，经100KD孔径的滤膜超滤浓缩30倍后进行柱层析，用0.02MpH7.2的PBS洗，收集第一峰；(5)、合并纯化后的病毒液，经0.22um的膜除菌过滤，然后加入人血白蛋白作为保护剂，半成品中人血白蛋白最终浓度为0.3％，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，抗原含量稀释至1∶128，加入0.5mg/ml的氢氧化铝佐剂。