一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法

摘要

本发明涉及一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法。方法包括将雄激素受体与环境类雄激素结合后，雄激素受体二聚化变构，结合含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′的生物素标记的DNA探针，形成生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物，并采用雄激素受体单克隆抗体对其吸附分离，再用链亲和素标记的辣根过氧化物酶进行ELISA检测，从而评估样本中类雄激素的效应和含量。本发明方法操作简便、快捷，灵敏度高，检测限可达pM级。可广泛用于食品、环境检测等领域。

主权项

一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)设计合成5′端用生物素标记的DNA探针正链，其全序列中含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n为任意核苷酸；(2)合成步骤(1)所述探针的碱基互补连，等量加入(1)所述探针，在退火缓冲液中退火，形成5’端用生物素标记的DNA双链探针；(3)将雄激素受体特异的鼠源性单克隆抗体McAb加入到羊抗鼠IgG包被的磁珠里，洗涤，得到McAb-磁珠固相载体；(4)将含环境类雄激素的待检样品与雄激素受体在结合缓冲液中4℃振摇孵育1小时，然后37℃孵育30分钟，使环境类雄激素与雄激素受体结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成雄激素受体-环境类雄激素复合物；(5)向步骤(4)复合物中加入步骤(2)所述5′端用生物素标记的DNA双链探针，37℃反应10分钟，形成生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物；(6)将步骤(5)所得生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物溶液中加入到步骤(3)所述的McAb-磁珠固相载体，形成雄激素受体-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附收集此复合物，洗去未结合的探针；(7)向步骤(6)所述的复合物中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育0.5-1小时，使DNA探针上标记的生物素与链亲和素特异性结合，磁力架收集磁珠复合物，洗去未结合的酶；(8)向步骤(7)磁珠复合物中加入辣根过氧化物酶的催化底物四甲基联苯胺和受氢体过氧化氢，37℃孵育10-30分钟，催化底物显色；(9)向步骤(8)已显色的混合液中加入含有硫酸的终止液终止显色反应，磁力架吸附磁珠，收集上清；(10)将步骤(9)收集的上清加入到聚苯乙烯酶标板，也即ELISA板，在ELISA检测仪上，于450nm处，测定各孔吸光度值，与以睾酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中类雄激素物质的累计当量。