变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用，本发明参照GenBank的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV与普通PRRSV的NSP2段基因序列，设计并合成了引物和TaqMan探针。通过对反应条件优化，标准质粒品构建，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR诊断变异型PRRSV方法。结果表明，该方法具有特异性强，敏感性高等特点，能够检测出264个拷贝数的标准质粒品，0.5623TICD50的病毒量，比RT-PCR敏感10倍。对22份病料样品进行检测，结果有8份为阳性，阳性率为36.4％。由于该方法具有定量、快速、准确、敏感等优点，适用于对猪群感染变异型PRRSV早、中、晚期的诊断，对有效诊断及防治高致病性猪繁殖与呼吸综合征的发生起到重要作用。

主权项

变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如下组分构成：DEPC水，5×AMV buffer，2.5mM/L dNTP，2.5umol/L Mgcl2，10x PCR Buffer，Nuclease Inhibitor，AMV反转录酶，LA TaqDNA聚合酶，Oligo(dT)18，100nmol/L上下游引物混合物，10nmol/LTaqMan探针，阳性质粒标准品，阴性对照品，(1)上下游引物混合物为：按照GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332、PRRSV-FJ04a、PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株的NSP2序列，用PrimerExpress5.0软件和Oligo6.0软件设计构建质粒的一对引物和探针，UPPrimer：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGT-3’LOW Primer：5’-AGCCTCATATTCCGTCTGTG-3’，目的片段大小为125bp，(2)TaqMan探针：荧光探针序列5’FAM-CCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCT-TAMRA 3’(3)阳性质粒标准品：所述的阳性质粒标准品按如下方法获得；(3.1)GenBank数据库提供的PRRSV-VR2332及PRRSV-JXwn06(EF641008.1)变异株序列基因序列的NSP2段，用Oligo6.0软件设计一对构建标准品质粒的引物U1，UpPrimer：5’-GAATATGGGCTCATGTCCACTG-3’，Low Primer：5’-ACATGCGAGAGAGCCACTCCTG-3’，目的片段大小为868bp，(3.2)RNA提取及RT-PCR病毒RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行，其RT-PCR反应体系及条件如下：RT反应体系为10μL：DEPC水1.25μL，5×AMV buffer 2μL，2.5umol/L Mgcl2 1.0μL，2.5mmol/LdNTP1.0μL，Oligo(dT)18 1μL，NucleaseInhibitor0.25μL，AMV反转录酶0.5μL，RNA模板3.0μL，反应程序为30℃10min，42℃1h，99℃5min。合成的CDNA置-20℃冰箱保存备用。PCR反应体系为20μL：无菌水13.2μL，10×PCR Buffer2.0μL，dNTP 1.6μL，LA-Taq酶0.4μL，UP、LOW引物各0.4μL，模板2.0μL。反应程序为95℃预变性5min，94℃变性1min，58.5℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。(3.3)按常规方法对扩增产物进行回收、目的片段连接到PMD-18T Vector及转化到感受态细菌DH5α。(3.4)阳性克隆鉴定挑取白色菌落进行小量培养，取1.5ml过夜培养物提取质粒，用HindIII与BamHI进行酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性菌株进一步扩培，菌液测序，(3.5)质粒定量取5μl提取质粒稀释到1ml，用核酸蛋白紫外分析仪准确测定OD260，然后算出质粒的质量及摩尔浓度，再乘以阿拂加德罗常数，换算成copies/ml，并进行10倍系列稀释，作为标准品-70℃保存。