一种基于双抗体识别的血清中MG7-Ag的定量检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及血清中MG7-Ag的检测方法，通过双抗体对MG7-Ag的识别、捕捉，在抗原信号转换的基础上结合实时荧光定量免疫PCR检测方法来实现精确定量检测血清中痕量抗原MG7-Ag含量。将实时荧光定量PCR技术与特异性的抗原抗体反应系统相结合，建立实时荧光定量免疫PCR技术。此项技术通过双抗体特异性的识别血清中MG7-Ag，然后用链亲和素分别结合生物素化MG7和生物素化的DNA，将血清中的MG7-Ag含量的信号转化为核酸信号后，进入实时荧光定量PCR扩展途径，从而精确检测血清中痕量抗原MG7-Ag。

主权项

一种基于双抗体识别的血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)包被：用包被缓冲液将单克隆抗体MGb2浓度稀释至10μg/ml，然后加入到realtime-PCR反应管中，每个反应管加入50μl，37℃孵育1h后用PBS-T液洗涤；2)封闭：每个反应管加入5mg/ml BSA作为封闭液，37℃孵育1h后用PBS-T液洗涤；3)抗原抗体反应：封闭完成后，相应的反应管中加入50μl的标准品或检测样品，4℃过夜，弃去液体，然后用PBS-T液洗涤；所述的标准品为梯度浓度稀释的MG7-Ag标准品；所述的检测样品为待测血清；4)生物素化的MG7抗体结合：抗原抗体反应完成后，每个反应管加入50μl生物素化的MG7抗体，37℃孵育1h后用PBS-T液洗涤；5)链亲和素结合：生物素化的MG7抗体结合完成后，每个反应管加入50μl的链亲和素，37℃孵育30min，PBS-T液洗涤；6)生物素化的DNA报告分子结合：链亲和素结合完成后，每个反应管加入50μl的生物素化DNA，37℃孵育30min后用PBS-T液洗涤；7)实时荧光定量PCR反应：以洗涤完成后每个反应管所得生物素化DNA为模板分别进行实时荧光定量PCR反应；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸30s；35～40个循环结束后于72℃延伸10分钟；以PCR扩增生物素化DNA的延伸温度72℃处读取荧光检测量，得到每孔对应的PCR扩增曲线；8)绘制标准曲线：根据标准品管对应的一组PCR扩增曲线，设定荧光检测阈值，得到该荧光检测阈值处的对应标准品管的一组循环数；根据每个标准品管的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；9)确定检测样品的循环数：根据检测样品管对应的一组PCR扩增曲线，得到每孔检测样品达到荧光检测阈值处的循环数；10)确定检测样品的MG7-Ag含量：根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。