抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用

摘要

本发明涉及病毒抗体研究，旨在提供一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用。该抗体的制备包括：对PRRSV N蛋白基因序列PCR扩增N基因从而进行抗原制备、动物免疫、特异性卵黄免疫球蛋白的提取的步骤。本发明以重组PRRSV-N蛋白为抗原免疫蛋鸡获得了特异性的抗PRRSV-N-IgY抗体，制备的特异性抗PRRSV-N-IgY抗体可用于PRRSV间接免疫荧光(IFA)检测。与兔源、鼠源等动物的抗体相比，IgY具有物理性质稳定，具有不激活哺乳动物补体，不结合哺乳动物Fc受体或细菌，不与类风湿因子(RF)发生非特异反应等，可明显降低假阳性出现率等优点。

主权项

一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备方法，包括步骤：(1)抗原制备对PRRSVN蛋白基因序列PCR扩增N基因，并引入EcoR I/HindIII酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，转化感受态E.coli BL21(DE3)pLysS菌株，挑取单菌落经PCR和测序鉴定；阳性克隆以1mmol·L-1IPTG诱导4h，提取表达产物用SDS-PAGE检测；Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化表达重组蛋白，Western blot检测免疫原性和Bradford法测定蛋白浓度，纯化蛋白作为抗原备用；(2)动物免疫以含150μg重组蛋白·mL乳剂-1的PRRSV-N重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1乳剂1mL对23周龄的海兰蛋鸡进行首免；分别间隔2周进行二免、三免，免疫原为N重组蛋白与弗氏不完全佐剂1∶1乳化后的乳化剂1mL，含250μg重组蛋白·mL乳剂-1；收集首免后第83～90天鸡蛋，4℃保存备用；(3)特异性卵黄免疫球蛋白的提取参照Akita EM所述方法进行卵黄抗体的粗提：将收集的鸡蛋以75％酒精消毒，破壳；以卵黄分离器收集卵黄，蒸馏水充分冲洗卵黄表面后在无菌滤纸上滚动，除去残留卵白蛋白，破卵黄膜，加卵黄液9倍体积pH5.2的蒸馏水稀释，充分搅匀后4℃静置6h以上，10000g，4℃离心25min，上清液备用；以硫酸铵分级沉淀精提卵黄抗体：水稀释法粗提的上清液分别以w/v终浓度为50％、33.3％硫酸铵盐析，4℃静置过夜；10000g，4℃离心25min，弃上清，沉淀用少量0.01M、pH7.2的PBS缓冲液溶解，并经截留分子量100KDa的超滤膜除盐浓缩。