用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法，该方法采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株，在含有碳源、氮源、无机盐和生物素的培养基中培养，经优化条件得到γ-聚谷氨酸发酵液，通过有机溶剂沉淀、透析、干燥得到γ-聚谷氨酸。本发明在发酵过程中不需要在培养基中加入L-谷氨酸前体，降低了生产成本，而且产量高。

主权项

用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是包括以下步骤，下述的各培养基成分按质量体积百分数计量，以水补足体积：1)枯草芽孢杆菌种子液的制备：第一步：选择能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH 6.0～8.0；第二步：从上述成熟的固体斜面上接种能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～3，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH 6.0～8.0；2)谷氨酸棒杆菌种子液的制备第一步选择能够产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.02％～4％，pH 6.0～8.0；第二步从上述成熟的固体斜面上接种谷氨酸棒杆菌菌体于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～5，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.2％～4％，生物素0.005％，pH 6.0～8.0；3)枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和发酵生产聚谷氨酸：第一步在摇瓶中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子，两种菌体的数量比为20∶1到40∶1，菌体总量在108-1012个/毫升范围内，进行混合培养发酵12～28小时，谷氨酸棒杆菌的发酵培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，生物素0.005％，pH 6.0～8.0；或者在小型发酵罐中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，控制溶解氧在20％以上，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子混合培养发酵18～40小时；第二步发酵结束后，用离心的方法去除发酵液中的菌体，将上清液的pH值调至3～5，然后加入有机溶剂，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥或者真空干燥得到γ-聚谷氨酸。