利用分子信标在线检测菌体转录水平的方法

摘要

本发明公开一种利用分子信标在线检测菌体转录水平的方法，步骤为：通过测定分子信标在不同缓冲溶液里的热力学特征，记录荧光值-温度变化曲线，选出对信号反应灵敏的备选缓冲液，分子信标和过量的cDNA在备选缓冲溶液里杂交，得到荧光值-时间变化曲线，信号噪声比最大者为最佳杂交缓冲溶液；在选定杂交缓冲溶液中，测定分子信标、以及分子信标和cDNA杂交体的热力学特征，获得荧光值-温度变化曲线，选出分子信标低背景，信标和cDNA杂交体有最大荧光值的温度段，在该温度段下，获得荧光值-时间变化曲线，具有最快反应速度者为最优反应温度；菌体mRNA定量。本发明在10min-30min内完成，实现发酵过程的在线控制。

主权项

一种利用分子信标在线检测菌体转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，分子信标的设计与cDNA的合成：根据所测目的基因具体序列，设计并合成具有茎环结构的分子信标，同时合成和分子信标环状区序列互补的cDNA单链；第二步，杂交缓冲溶液的最优化：通过测定分子信标在不同缓冲溶液里的热力学特征，记录荧光值-温度变化曲线，选出对信号反应灵敏的备选缓冲液，分子信标和过量的cDNA在备选缓冲溶液里杂交，得到荧光值-时间变化曲线，计算信号噪声比，信号噪声比最大者为最佳杂交缓冲溶液；所述杂交缓冲溶液的最优化的步骤包括：a)分子信标加入预选的缓冲溶液中，从25℃逐渐升温到94℃，每个温度下保持30s-5min，记录每个温度下的荧光值，获得荧光值-温度变化曲线，选出对信号灵敏的备选缓冲溶液；b)分子信标和过量的cDNA加入备选缓冲溶液中，温度25℃-50℃下反应，隔30s-150s记录测得的荧光值，直到所有荧光值不再随时间变化，获得荧光值-时间变化曲线；c)按公式S∶B＝(Fopen-Fbuffer)/(Fclosed-Fbuffer)计算信号噪声比S∶B，信号噪声比值最大者为最佳杂交缓冲溶液，其中：Fopen指分子信标与目的序列杂交后的荧光值，Fclosed指分子信标不存在目的序列时的荧光值，Fbuffer指杂交缓冲溶液的荧光值；第三步，杂交温度的最优化：在第二步选定的杂交缓冲溶液中，测定分子信标、以及分子信标和cDNA杂交体的热力学特征，获得荧光值-温度变化曲线，选出分子信标低背景，信标和cDNA杂交体有最大荧光值的温度段，在该温度段下，测定分子信标和cDNA杂交的动力学特征，获得荧光值-时间变化曲线，具有最快反应速度者为最优反应温度；所述杂交温度的最优化，具体实现如下：a)在选定的杂交缓冲溶液中，分子信标、以及分子信标和过量cDNA的杂交体分别从25℃逐渐升温到94℃，每个温度下持续30s-5min，记录每个温度下的荧光值，获得荧光值-温度变化曲线，选出分子信标有低背景值，信标和cDNA杂交体有最大荧光值的温度段；b)选定的温度段中，取确定的温度进行动力学实验，每隔30s-150s记录分子信标和cDNA杂交体的荧光值，获得荧光值-时间变化曲线，具有最快反应速度者确定为最优反应温度；第四步，菌体mRNA定量：用和分子信标互补的cDNA代替RNA，建立cDNA浓度和荧光信号值之间的标准曲线，提取菌体总RNA后进行杂交，检测荧光值，利用标准曲线计算菌体mRNA浓度；所述菌体mRNA定量，具体实现如下：a)标准曲线建立：用和分子信标互补的cDNA代替RNA，从低到高作一系列浓度稀释，和分子信标杂交，记录稳定情况下荧光值，建立cDNA浓度和荧光信号值间的标准曲线；b)菌体总RNA提取；c)RNA和分子信标在第二步和第三步确定的杂交缓冲溶液和杂交温度下杂交，10min-30min后检测荧光值，利用标准曲线计算mRNA浓度。