一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法

摘要

本发明公开了一种用于评价植物根系土壤微生物群落多样性的微生物基因组DNA提取方法，在细胞裂解以前对样品进行前处理，将胞外DNA及腐殖质进行去除，避免了纯化步骤存在腐殖质去除困难和DNA回收率低的问题。本发明提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。所提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，以评价植物根系微生物群落多样性。

主权项

一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向0.1-5g土壤样品中加入1.5-10mL样品浸洗液A，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-10分钟，弃去上清液，重复3次；(2)向由上述步骤(1)得到的土壤中加入1.5mL样品浸洗液B，冰上放置5-30分钟，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-8分钟，弃去上清液，重复3次；(3)向由上述步骤(2)得到的土壤中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸缓冲液C到样品中，漩涡震荡2-10分钟；(4)向由上述步骤(3)得到的土壤悬浊液加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000rmp离心5-10min，沉淀碎片；(5)将由上述步骤(4)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质；(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min；(7)将由上述步骤(6)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；(8)将由上述步骤(7)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。(9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次；(10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rmp离心1-5min；(11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rmp离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。其中洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。