一种小麦试管苗叶片反复再生的方法

摘要

本发明涉及一种通过小麦试管苗叶片的组织培养使小麦试管苗反复再生的方法，属于植物组织培养技术领域，其步骤包括：(1)胚性愈伤组织的诱导；(2)愈伤组织的继代培养；(3)试管苗的获得；(4)试管苗叶片诱导愈伤组织；(5)二次再生苗的诱导；(6)诱导生根；(7)二次再生苗的移栽。本发明所提供的小麦试管苗幼叶反复再生的方法成功解决了小麦试管苗反复再生难的问题，是国内外首次通过小麦试管苗幼叶建立起小麦试管苗反复再生体系，使运用叶绿体转基因技术获得同质化的叶绿体转基因小麦成为可能。经试验统计：通过使用本方法试管苗叶片诱导愈伤组织的频率及二次再生苗的频率分别达到了93％和66％以上。

主权项

1.一种小麦试管苗叶片反复再生方法，步骤包括：(1)胚性愈伤组织的诱导(2)愈伤组织的继代培养(3)试管苗的获得(4)试管苗叶片诱导愈伤组织(5)二次再生苗的诱导(6)诱导生根(7)二次再生苗的移栽；其特征在于：步骤(1)胚性愈伤组织诱导的方法是：取开花后14～16天的小麦未成熟麦穗，于体积比为75％酒精中浸3～8分钟灭菌；然后将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚；再挑选直径0.8～1.2mm的幼胚，盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基I上，25±1℃，黑暗培养2～3周；获得胚性愈伤组织；步骤(2)愈伤组织继代培养的方法是：取步骤(1)获得的愈伤组织，先切除其上由幼胚长出的胚芽，再把愈伤组织转移到胚性愈伤组织继代培养基上，光照强度为55～65μmol·m^-2·s^-1，光照时间10～14h·d^-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，2～3周继代一次；步骤(3)试管苗获得的方法是：将步骤(2)所述继代一次以上的胚性愈伤组织转至分化培养基I，光照强度为75～125μmol·m^-2·s^-1，光照时间14～18h·d^-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，培养2～3周形成丛生试管苗；步骤(4)试管苗叶片诱导愈伤组织的方法是：待步骤(3)培养的试管苗长到2～5cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部1～3mm的叶段放至愈伤组织诱导培养基II上，25±1℃条件下暗培养3～4周，在叶段的切口处有3～4mm的愈伤组织团形成；步骤(5)二次再生苗诱导的方法是：将步骤(4)中诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至分化培养基II上，光照强度为75～125μmol·m^-2·s^-1，光照时间14～18h·d^-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养3～4周，诱导出二次再生的试管苗；步骤(6)诱导生根的方法是：将步骤(5)中获得的二次再生苗转至生根培养基，光照强度为75～125μmol·m^-2·s^-1，光照时间14～18h·d^-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养3～4周，得生根植株；步骤(7)所述二次再生苗移栽的方法是：将步骤(6)中生根的二次再生试管苗转至20±1℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗2～4天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，相对湿度控制在50％～60％之间，经4～7天的适应，移至大田；其中：上述混合育苗基质的成分以体积比计为：营养土∶蛭石＝3∶1，花盆高度为15cm，花盆中所放育苗基质厚度为12cm；上述愈伤组织诱导培养基II配方是：MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L L-天冬酰胺+1.7～2.3mg/L 2，4-D+0.8～1.2mg/L NAA+7～9g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.7～5.9；上述分化培养基II配方是：MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.4～0.6mg/L TDZ+0.8～1.2mg/L 6-BA+0.45～0.55mg/L IAA+5～15mg/L AgNO₃+0.5～1.5mg/LTIBA+5～7g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8；上述MS基本成分及B5维生素为：