CARBOXIPEPTIDASA B RECOMBINANTE Y SU PURIFICACION.

摘要

Un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de (a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en una procarboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, siendo el péptido señal la secuencia N-terminal de la pre-proteína, e insertándose opcionalmente entre la cola de histidinas y el péptido señal o entre la cola de histidinas y la carboxipeptidasa B de rata una secuencia espaciadora; (b) transformar un organismo microbiano huésped con el vector; (c) cultivar el organismo microbiano huésped en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, expresando el organismo microbiano huésped la pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina al medio de cultivo; (d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada al medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unir la cola de histidinas, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, inmovilizándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina; (e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, escindiéndose así proteolíticamente la porción pro-carboxipeptidasa B y liberándose la proteína con actividad carboxipeptidasa B a la fase líquida, mientras la porción propéptido con colas de histidina está inmovilizada; (f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que está inmovilizada la porción propéptido con colas de histidina; y (g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).