检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法

摘要

检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法，它涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。它解决了现有检测牛病毒性腹泻病毒的方法存在成本昂贵，需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段畜牧业发展状况的问题。方法：首先设计引物，然后配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成。使用方法：取含牛病毒性腹泻病毒样品的RNA提取物，加入反应液，混合后进行逆转录环介导等温扩增反应，再离心检测；或加入10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外灯下检测；或进行电泳检测；或采用Real-time PCR仪进行保温反应检测。本发明反应试剂盒的检测方便，无需昂贵仪器，降低成本。

主权项

检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备方法，其特征在于检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备方法按以下步骤实现：一、从基因数据库中检索所有牛病毒性腹泻病毒的基因序列，通过Clustalw软件分析找出特异性的保守靶DNA序列，然后利用Primer Explorer 4软件设计6条引物；二、根据所得的6条引物配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成检测牛病毒性腹泻病毒的逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备；其中步骤一中保守靶DNA序列为：TGAGGGACAAATCCTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTTGTGCGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGTTCAGGTGAAAACGGTTTAACCAACCGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATCGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATTACAAATG；步骤一中6条引物分别为：名称 序列F3 5’-TGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3’B3 5’-AGCACCCTATCAGGCTGTA-3’FIP 5’-CGAACCACTGACGACTACCCTGTTTTGGTAGCAACA GTGGTGAGTT-3’BIP 5’-CAAGCCTCGAGATGCCACGTTTTTCCGTTTTCACCTG AACGACC-3’FL 5’-AGGGCTTCAGCCATCCAACG-3’BL 5’-CAGCACATCTTAACCTGAGCGG-3’；步骤二中逆转录环介导等温扩增反应液为每20μl反应液由1.9μl的Nuclease-Free水、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、0.1μl的1M Mg2SO4、2μl的5M Betaine、4μl的10mM dNTP、1μl的20×SYBR GREEN I、1μl的5μM引物F3、1μl的5μM引物B3、1μl的20μM引物FL、1μl的20μM引物BL、1μl的40μM引物FIP、1μl的40μM引物BIP、1μl的8U/μl BstDNA聚合酶、0.5μl的40U/μl Ribonuclease Inhibitor和1μl的10U/μl AMV ReverseTranscriptase组成。