筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法

摘要

本发明公开了属于分子生物学及生物制药技术范畴的一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法。利用酵母转录激活因子的DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)在空间上可分离的特点，在桥质粒pBridge的BD域下游插入X基因，在第二个条件型甲硫氨酸启动子(RMET25)下游插入以硫氧还蛋白为骨架的随机10肽库，将Y基因插入到含有AD域的pACT2，共转酵母宿主细胞，利用营养缺陷型和相应报告基因的表达来筛选促X-Y解离的小肽分子。该方法为研究蛋白质复合物的解离提供新的途径；获得的解离肽可有效阻断信号通路中的重要蛋白复合物，为治疗由于信号转导通路异常导致的疾病如自身免疫、肿瘤等提供药物靶点。

主权项

一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法，其特征在于，所述筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法包括：1)载体采用如图1所示的购自Clontech公司的具有双启动子的桥质粒pBridge载体，pBridge在BD域的下游具有MCS I，能诱导BD融合蛋白的表达，此外，pBridge还具有MCS II，受控于甲硫氨酸启动子PMET25，当甲硫氨酸缺乏时，能诱导第三个蛋白的表达，为研究三个蛋白之间的相互作用奠定基础；采用如图2所示的购自Clontech公司的pACT2，在AD域下游具有MCS，能诱导AD融合蛋白的表达；2)骨架蛋白选择骨架蛋白选用硫氧还蛋白TrxA，TrxA通过两个Cys形成一个突环区，在该突环区插入编码10肽的随机DNA片段，编码的小肽因构象受限而形成较为稳定的结构，有利于筛选到具有高亲和力的配基，在TrxA的突环区只有一个Rsr II酶切位点，设计两对引物，通过重叠延伸PCR向TrxA的突环区引入Asc I酶切位点，有利于随机DNA片段定向插入；其中骨架蛋白TrxA的调取与改构设计一对引物，pL 1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’pR2：5’GAAGATCTTCACAGGTTAGCGTCGAGGAACTC-3’在引物的上游引入Not I酶切位点，下游引入Bgl II酶切位点；如图6所示，从E.coli JM109宿主菌基因组中调取324bp的TrxA基因，回收TrxA pCR产物，与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，由上海申能博彩公司测序；测序正确后，另外设计一对引物：pL2：5’-CGTATGTTGGGCGCGCCTGCAAAATGATCGCCCCGATTC-3’pR1：5’-GGCGCGCCCAACATACGGACCGCACCACTATGC-3’通过重叠延伸PCR，获得在TrxA的凸环区引入Asc I酶切位点的改构的TrxAc基因，经Not I、Bgl II双酶切插入到pBD的MCS II，测序结果正确；3)相互作用蛋白的选择选择信号转导通路中具有明确相互作用的重要蛋白复合物为靶标，在获得已知具有相互作用的蛋白X、Y基因的基础上，构建pBD-X和pAD-Y重组载体，利用酵母双杂交系统验证X-Y的相互作用，然后以X-Y复合物靶标，利用随机肽库筛选促X-Y解离的小肽分子，所述B细胞激活因子BAFF主要与受体BAFF-R结合，由BAFF-R介导胞内信号转导而发挥其生物学效应；调取BAFF-R和下游分子TRAF-C基因，构建pBD-BAFF-R和pAD-TRAF-C重组载体，共转酵母宿主细胞在BAFF-R和TRAF-C具有相互作用的基础上，再以BAFF-R和TRAF-C复合物为靶标，筛选促BAFF-R和TRAF-C解离的小肽；其中随机肽库的构建如下：3.1线性化载体的制备提取pBridge-TrxAc质粒，Asc I、Rsr II进行双酶切，利用Omega胶回收试剂盒回收酶切产物，CIAP酶进行去磷酸化处理，在Eppendorf管中加入适量酶切产物，缓冲液及CIAP酶，去离子水补充至50μl，混匀后50℃水浴30min，75℃水浴15min灭活CIAP酶，去磷酸化产物用酚∶氯仿1∶1抽提两次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀后，-20℃；3.2编码10肽的随机DNA片段的制备根据TrxAc突环区的Rsr II、Asc I酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计两条寡核苷酸片段，链1：5’-GTGGTGCGGTCCGNNK10GGGCGCGCC TTAATGAT-3’，其中N代表A、G、C、T四种碱基，K代表G、T两种碱基；在5’和3’端引入Rsr II、Asc I酶切位点，用下划线表示，链2：5’-ATCATTAAGGCGCGCCC-3’与链1的3’端互补；在一Eppendorf管中加入10×退火Buffer2μl，100pmol/μl的DNA单链各1μl，H2O 11μl，95℃加热10min，缓慢降至室温，在继续加入2.5mmol/L的dNTPs 2μl，Klenow大片段1μl，10×Klenow缓冲液2μl，25℃水浴15min，75℃20min灭活Klenow酶，将退火延伸的随机片段经Asc I、Rsr II双酶切，15％的PAGE分离回收目的条带；4)文库构建采用NNK编码方式，构建10肽随机文库，N代表任意核苷酸，K代表G或T，指导合成全部20种氨基酸和一个TAG琥珀型终止子；将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转E.coli感受态细胞；5)随机肽库库容和多样性检验取1μl扩增的DH10B肽库菌液，梯度稀释后涂布LB平板，计算库容，随机挑选20个克隆进行测序，对其多样性进行检验；所述高通量筛选蛋白相互作用，其中，解离肽的实施是以酵母双杂技术作为基础，将酵母三杂交和多肽文库技术相融合，构建双启动子解离肽筛选文库；用具有相互作用的两种蛋白质X与Y，高通量筛选促X与Y复合物解离的多肽，将pBD-X与pAD-Y共转染酵母宿主细胞，当蛋白X与Y具有相互作用时，导致AD与BD在空间上靠拢，则激活相关下游基因的转录，在pAD或pBD上导入另一诱导的启动子序列，并在其下游插入6～12肽的随机多肽文库，为增大筛选的机会利用构象型肽库或偏性肽库，在共转pBD-X/Z与pAD-Y，或pBD-X与pAD-Y/Z后，利用相关的营养缺陷型培养基启动多肽文库的表达，筛选出能够阻断X与Y相互作用的解离肽。