一种条件性基因敲除载体的构建方法

摘要

一种高效并且合理的完成条件性基因敲除载体的构建方法。包括如下步骤：设计出包含15bp重组序列的左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并PCR扩增出L、R和M，经过三次线性化载体，体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)重组，转化感受态的步骤，完成最终载体的构建工作。本发明极大的节省了构建时间，且阳性克隆率极高，适合长片段的同源臂。此方法不仅可以用于小鼠条件性基因敲除载体的构建，而且可以用于符合此基因敲除原理的其它物种的条件性基因敲除载体构建工作，同时还可用于基因敲入载体的构建。

主权项

一种条件性基因敲除载体的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：第1、设计引物：按常规设计左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并在引物的5’端加入如下序列：L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCCL下游引物加入ACGAAGTTATGGATCCM上游引物加入TAGGAACTTCGTCGACM下游引物加入AAATGACGTGGTCGACR上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCCR下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC；第2、PCR左右同源片段L、R和要敲除的序列M，回收片段；第3、BamHI酶切基本质粒，回收，根据实际情况，也可先切其他两个位点；第4、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，载体和片段L按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37℃摇床200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第5、将第4步鉴定正确的质粒用AscI切，回收；标记为+pL第6、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第5步得到的载体+pL和片段R按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升转化感受态细胞；转化后加LB500微升200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第7、将第6步鉴定正确的质粒用SalI切，回收；标记为+pLR第8、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第7步得到的载体+pLR和片段M按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升转化感受态细胞；转化后加LB500微升200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第9、测序鉴定最终得到的基因敲除载体。