一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒

摘要

本发明涉及一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法。方法包括将痕量环境内分泌干扰物与雌激素受体结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雌激素反应元件核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’的DNA双链探针，形成配体-ER-DNA探针复合物，并采用单克隆抗体对其吸附并分离，然后进行实时荧光定量PCR定量扩增，从而评估样本中EDCs的生物学效应。本发明方法操作简便、快捷，灵敏度高，达到甚至超过HPLC-MS/GS分析化学方法。可广泛用于食品、环境检测等领域。本发明还涉及所述方法所采用的试剂盒，使用操作简便、快捷、灵敏，检测范围100pM～1nM。

主权项

1一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)表达并纯化具有生物活性的重组人雌激素受体α(hERα)：采用pSG5载体与人ERαcDNA构建质粒pSG5-hERα，酶切后导入杆状病毒真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)，得到杆状病毒表达质粒hER-Bacmid，转染Sf9细胞高效表达hERα，分离并纯化hERα；(2)设计DNA双链探针，其全序列中含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸；(3)制备重组人雌激素受体α(hERα)特异的单克隆抗体(ERαMcAb)：肽合成仪合成hERα A/B区一段18个氨基酸的多肽，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选hERα抗原特异性杂交瘤株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能特异结合hERα的McAb；(4)针对步骤(2)所述DNA双链探针，设计荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应引物，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为：MGB-TaqMan：FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB上游引物FP：5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’下游引物RP：5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’(5)将步骤(1)所得hERα与待检样品在结合缓冲液中4℃振摇孵育4h，使EDCs与hERα结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成配体-ERα复合物；(6)向步骤(5)复合物中加入步骤(2)所述双链DNA探针，4℃过夜，形成配体-ERα-DNA探针复合物，也即ERC；(7)向步骤(6)所得ERC溶液中加入步骤(3)所制备的ERαMcAb，形成ERC-McAb，用磁珠包被的二抗羊抗鼠IgG结合McAb，形成ERC-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附分离此复合物，洗去未结合的探针；(8)加热步骤(7)所分离复合物，使DNA双链探针游离出来；(9)对游离出来的DNA双链探针，用步骤(4)所述MGB-TaqMan探针和引物，进行实时荧光定量PCR定量扩增，25μl反应体系：2X Taqman探针主要反应混合液12.5μl，MGB-Taqman探针0.3μl、引物FP和RP各0.5μl、HotStar DNA聚合酶0.4μl、DNA模板2μl、加去离子水至总量25μl，扩增条件：95℃预变性15min，95℃5s、59.5℃25s，40个循环，与以雌二醇(E2)为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中具有类雌激素作用物质的累计当量。