用分光光度计测定糖化酶活力的方法

摘要

一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，属于生物化学分析领域。用分光光度计来测量由糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应对波长为520nm光的吸收，来确定糖化酶酶活。该方法包括梯度样品的制作、梯度样品吸光度的测定、待测糖化液的制备、空白液制备、酶活力的测定。此方法简单，快速，灵敏度高，准确及时地指导糖化酶工业化生产。

主权项

1.一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：(1)梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；(3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；(4)空白液制备：于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；(5)酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取0.05～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比色，记录吸光度；(6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。