切割来自β-2-微球蛋白基因之DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

摘要

本发明涉及一种I-CreI变体，其具有至少两个替换，所述替换各自位于LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域之一中，所述亚结构域分别位于I-CreI的26到40位以及44到77位，所述变体能够切割来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列。本发明还涉及所述变体和衍生产物用于预防和治疗异体移植排斥以及与β-2-微球蛋白的纤丝构象相关之病症的用途，以及用于制备表达异源目的蛋白的转基因动物和重组细胞系的用途。

主权项

1.一种I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，所述替换各自位于LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域之一中，所述亚结构域位于I-CreI的26到40位和44到77位，所述变体能够切割来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列，并且所述变体可通过至少包括下述步骤的方法而获得：(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的26到40位，(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，(c)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，(d)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于所述来自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，(e)从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，(f)从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变I-CreI位点的变体，在所述突变位点中，(i)I-CreI位点中+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体所替换，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列所替换，(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位和44到77位的突变在单个变体中组合，以获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，在所述序列中，(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，并且(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中26到40位和44到77位的突变在单个变体中组合，以获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，在所述序列中，(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，并且(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(i)将步骤(g)和(h)中所获得的变体相组合以形成异二聚体，以及(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列的异二聚体。