一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测技术法，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物以及PCR模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂，利用该多重PCR检测技术能扩增待测菌株氯霉素类药的耐药基因。它具有灵敏度高、特异性高、应用范围广，结果准确可靠的特点。

主权项

1.一种动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测方法包括以下步骤：[1]PCR模板的制备方法如下：(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液或血液；(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养3-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000rin离心3min，弃上清，再加入1mlPCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200μlPCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用；[2]动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR扩增试剂的配置方法：(1)根据现有技术合成上述耐药基因特异性引物Cat1、FloR、CmlA，所述特异性引物序列如下表：用1mmol Tris·HCl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；(2)取PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物，浓度为25mM/LMgCl₂，Catl基因、FloR基因、CmlA基因的特异性上下游引物，DNA聚合酶和超纯水装入无菌的PCR反应薄壁管中；[3]动物源细菌氯霉素类药物耐药基因多重PCR检测方法中试剂的组成：(1)10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μl，浓度为25mM/LMgCl₂3μl，浓度为2.5U/μlTaq DNA聚合酶0.15μl，浓度均为25mmol/LCat1基因、FloR基因、CmlA基因特异性上下游引物分别0.2μl、0.4μl、0.9μl；(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可；[4]PCR扩增循环参数为：(1)94℃预变性5min；(2)然后进入循环：94℃变性50s、54℃退火1min、72℃延伸1min，共34个循环，最后72℃延伸5min后，取出于4℃保存；[5]耐药基因检测结果判定(1)取5μlPCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果可见约550bp、650bp、的条带，分别指示Cat1基因、FloR基因、CmlA基因；(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起进行DNA测序。