一种血管生长抑制因子Kringle 5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法

摘要

本发明涉及一种血管生长抑制因子Kringle 5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法。包括以下步骤：1.ThioA/L15/7和E.coli PET32(载体)质粒DNA的制备；2.目的基因Kringle5的PCR；3.PCR产物的抽提纯化；4.双酶切PCR产物以及载体质粒DNA；5.DNA凝胶回收；6.制备重组载体pET32/kringle5；7.感受态细胞的制备；8.感受态细胞的转化；9.小型发酵及重组蛋白的诱导表达；10.培养并提取质粒，双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。成功构建pET28a(+)-K5基因的非融合表达载体。为K5基因在大肠杆菌中的非融合表达的研究奠定了基础。

主权项

1、一种血管生长抑制因子Kringle 5融合基因的克隆、鉴定和表达方法，其特征在于：包含以下步骤：1]、ThioA/L15/7和E.coli PET32(载体)质粒DNA的制备：(1)质粒提取试剂溶液I：每瓶约100毫升，含50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL(PH8.0)，10mmol/L EDTA(PH8.0，)在6.895*10⁴Pa灭菌15min，储存于4℃；溶液II：0.2mol/L NaOH(临用前贮存液现用现配)i％SDS；溶液III：配成100ml含5mol/Lkac 60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml；溶液I，溶液III于150kg/cm2，灭菌20分钟；以上试剂均为国产分析纯；(2)操作在超净工作台中将2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基加入到容量为15ml试管中，接入ThioA/L15/7单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜，吸取1.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余贮存于4℃。含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基在上述沉淀中加入100ul用冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全分散；在加入200ul新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；在加入150ul用冰预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后置于冰上5min，加入RNAase 3ul，于60℃水浴20min，12000g离心5min，将上清转入另一加入200ul苯酚和200ul 24∶1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合使双链DNA沉淀，室温下放置2min，在于12000g离心3min，吸取上清液于另一离心管中，用800ul纯乙醇洗涤双链DNA，摇匀，在冰箱冷冻区静置两小时，12000g离心5min，除去上清，贴壁缓慢加入70％冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37℃烘箱烘干，用25ul无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5ul做1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-20℃；载体pET32a质粒DNA制备同上；2]、目的基因Kringle5的PCR：(1)试剂引物序列：上游引物：5’GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3’Nco I25bp下游引物：3’GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3’EcoR I28bpTaq-DNApolyase是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的5’→3’外切核酸酶活性，最佳作用温度为75℃--80℃，需要在低于最适温度的条件下起始聚合反应，以免引物从模板上解离，Taq-DNApolyase作用时需要Mg²⁺.由于引物：模板杂交体的解链和退火温度受二价阳离子的影响，需考虑扩增反应的最佳Mg²⁺浓度。磷酸盐缓冲液抑制Taq-DNApolyase活性，扩增反应通常在Tris缓冲液中进行，该缓冲液在室温下pH为8.3；(2)操作200ul离心管中加入10×Buffer 5ul，dNTP 4ul，引物P12ul，P22ul，模板质粒2ul，Taq-DNApolyase 0.5ul，无菌水34.5ul，使反应体系总体积为50ul，最后用少量液体石蜡密封，在PCR仪上进行反应；取5ul PCR反应产物和1ul marker进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。3]、PCR产物的抽提纯化(1)试剂TE(Ph＝8.0)：10mmol/L Tris-Hcl(PH＝8.0)+1mmol/L EDTA(PH＝8.0)(2)操作将PCR产物转移至1.5ml离心管，加入TE(PH8.0)补足140ul，加入苯酚和24∶1的氯仿/异戊醇溶液各70ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入24∶1的氯仿/异戊醇溶液140ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入14ul 3M NaAc及420ul(3倍体积)无水乙醇，在-70℃冰箱中静置2小时，取出后于15000g离心15min。加入1ml 70％乙醇洗涤，于15000g离心15min，放入烘箱干燥，取5ul进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。4]、双酶切PCR产物以及载体质粒DNA：(1)试剂Nco I酶切位点：5’..A T G G..3’3’..G G T A C_▲C..5’热失活性65℃，20minEcoR I酶切位点：5’..A T T C..3’3’..C T T A A_▲G..3’热失活性65℃，20min(2)操作向离心管中加入10×Buffer 2ul，0.1％BSA 2ul，PCR产物14ul，Nco I1.2ul，EcoR I 0.8ul，总反应体积为20ul，向离心管中加入10×Buffer 2ul，0.1％BSA 2ul，载体质粒DNA 12ul，NcoI 1.2ul，EcoR I 0.8ul，无菌水2ul，总反应体积为20ul，将上述两离心管于36℃±水浴过夜，将酶切产物全部进行2％琼脂糖凝胶电泳；5]、DNA凝胶回收：(1)试剂DNA凝胶回收试剂盒包括DE-A：凝胶融化剂(含DNA保护剂)DE-B：高离液序列溶液(使大于100bp的DNA片段选择性的结合到DNA制备膜上)W1：洗涤液W2：洗涤液洗脱液：2.5mM Tris-Hcl，Ph＝8.5(2)操作首先紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶，用纸巾吸干并切碎，肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA凝胶重0.08g，载体DNA凝胶重0.11g，分别作为一个凝胶体积.分别向其中加入5个凝胶体积的DE-A溶液，混和均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化.加入0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀，由于肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA分子量为300bp，向其中再加入异丙醇至终浓度为20％.分别吸取上述混合物，转移到DNA制备管中，放置于2ml离心管中，于3600rpm离心1min，如有残留，提速再离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。重复一次将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，最高速离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul洗脱液，室温静置1min。最高速离心1min洗脱DNA，分别得到目的基因Kringle5的双酶切片段和载体pET32a的双酶切片段；6]、制备重组载体pET32/kringle5(1)试剂T4 ligase可催化双链DNA或RNA中的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键，可连接两个平末端，可修复dsDNA，dsRNA，RNA/DNA的缺刻。热失活性65℃，10min，(2)操作10×Buffer 1ul，Kringle5的双酶切片段4ul，载体pET32a的双酶切片段2ul，T4ligase 1ul，H₂O 2ul.总反应体积为10ul.16℃恒温过夜酶连；7]、感受态细胞的制备(1)试剂0.1mol/L Cacl₂溶液0.1mol/L CaCl₂-甘油溶液：25％甘油+0.1M CaCl₂(2)操作从37℃培养16-20小时的BL21新鲜平板上挑取一个直径2-3mm的单菌落，转移到一个含有50ml培养基的1升烧瓶中，37℃300转/min振荡3小时，在超净台中，将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，继续在冰上放置10分钟。于4℃4000rpm离心10min回收细胞，倒去培养液，将管倒置1分钟使残留培养液流尽，用10ml用冰预冷的0.1mol/L Cacl₂重悬沉淀，放置于冰上，于4℃4000rpm离心10min，倒出培养液，倒置1min，使残留培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂-甘油重悬每份细胞沉淀，将此溶液分成200ul/每管，若做转化，直接使用，若保存，则每管中加入7ul DMSO(二甲基亚砜)，冰上放置15min，加7ul DMSO，直接放置于-70℃冰箱中，或直接加水于-70℃保存；8]、感受态细胞的转化从-70℃冰箱中取出一管200ul的感受态细胞BL21，手中握化放置到冰上，每管中加入2ml重组载体pET32/kringle5，轻轻旋转，在冰上放置30mim，将管放到42℃水浴中慢慢振摇90s，快速转至冰浴中冷却2min，另取5ml小试管，每管加500ul未加抗生素的LB培养基，用水浴加温至37℃，将上面已经转化的感受态细胞BL21加入其中，放置于37℃摇床上220rpm以下温浴45分钟，使转化了的BL21复苏并且表达重组载体pET32/kringle5氨卞抗性标记基因，将上述1ml温浴的培养液5000rpm离心5分钟，吸去上面的500ul，下面的200ul用于铺板，在超净工作台上，将此200ul已转化的感受态细胞转移到事先放于37℃烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB琼脂培养基上，平板倒置于37℃下培养14小时左右可出现菌落；9]、小型发酵及重组蛋白的诱导表达(1)试剂诱导剂IPTG，0.1M Tris-HCl(PH8.0)，1mg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制备分离胶现配成5ml其中H₂O 1.434ml，30％丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，10％SDS 0.05ml，10％(NH₄)₂S₂O₈0.05ml，TEMED(凝固剂)0.002ml.浓缩胶现配成2ml其中H₂O 1.434ml，30％丙烯酰胺0.33ml，1.0mol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10％SDS 0.02ml，10％(NH₄)₂S₂O₈0.02ml，TEMED(凝固剂)0.002ml.(2)操作挑取上述转化后的培养出的单菌落至含有7ml培养液的试管中，37℃300rpm振荡过夜，吸取200ul培养物以1∶30接种于含100ug/ml氨卞的LB培养基中，37℃300rpm振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1mmol/ml，再于37℃300rpm振荡3小时，取1.5ml诱导菌，离心收集菌体，用200ul 0.1M Tris-HCl(PH8.0)重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入100ul 0.1M Tris-HCl(PH8.0)重悬菌体，再加入50ul 1mg/ml溶菌酶，于-70℃冰箱放置半小时，37℃水浴5分钟，再放入-70℃冰箱5分钟，反复冻融五次后，于12000rpm离心10分钟，收集上清(为细胞质部分)，沉淀为包涵体部分，上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE，染色，脱色，成像；10]、培养并提取质粒，双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定挑取转化后的BL21单菌落于2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基中，按照1.2.1提取质粒，按照1.2.4进行双酶切后，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。