百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法

摘要

本发明涉及一种百合病毒的多重逆转录-聚合酶链反应快速检测方法，通过设计并合成百合潜隐病毒(LSV)、百合花叶斑驳病毒(LMoV)、百合黄瓜花叶病毒(CMV)全序列引物，并对三种引物的浓度、三重PCR扩增温度、扩增时间和循环次数等条件进行优化，把3对引物加入同一个反应体系，就能从病毒模板中分别扩增出这3种百合病毒条带，达到一次PCR扩增就可检测出此3种病原的目的，为生物技术领域的病毒检测方法开辟了一条准确、高效、快捷的新途径，同时有效降低了百合病毒检测成本，加快了检测速度，拓宽了检测深度及广度，实现了百合病毒分子多重快速检测的高效性、灵敏性和特异性。具有广阔的应用前景。

主权项

1、一种对百合黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)三种病毒的同步检测方法，包括引物设计、总RNA模板的制备、逆转录和cDNA合成、PCR扩增、扩增产物检测、结果判断，其特征在于：(1)、设计下列用于多重逆转录聚合酶链式反应的引物：LSVCP1-F：5’-ATGCAATCAAGACCAGCACA-3’LSVCP2-R：5’-TCATCCATTATTTGCGTATC-3’LMoV-F：5’-TGGGCACCTTGTGAATTACA-3’LMoV-R：5’-TGCTGTATGCCTCTCCGTGT-3’CMV-F：5’-CgTTCACATCTATCACCCTA-3’CMV-R：5’-TACTTTCTCATgTCgCCTAT-3’(2)、逆转录和cDNA合成在Eppendorf PCR管中，依次加入以下试剂：双蒸水ddH2O 8.0μL50～100pmol/μL随机引物 0.5μL制备的受测百合植株总RNA 2.0μL70℃变性10min，冰上放置5min5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL10～20mmol/L dNTPs 4.0μL40～80u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL100～200u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中37℃反应1h，合成出cDNA，进行PCR扩增或保存于-20℃；(3)、PCR扩增依次在Eppendorf PCR管中加入以下试剂：双蒸水ddH2O 31.5μL10×PCR缓冲液 5.0μL10～20mmol/L dNTPs 2.0μL20～25pmol/μL LSV上游引物 1.0μL20～25pmol/μL LSV下游引物 1.0μL25～30pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL25～30pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL40～45pmol/μL CMV上游引物 0.5μL40～45pmol/μL CMV下游引物 0.5μL5～10u/μL rTaq聚合酶 1.0μL20～50ng cDNA 5.0μL总体积 50.0μL充分混匀，短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增，反应模式为递降式PCR，具体程序为：94～95℃预变性10min，前10个循环为94℃变性30s，退火30s，即每循环降1℃，从64℃降至54℃，72℃延伸60s，后20次循环为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，最后72℃延伸10min；(4)、扩增产物检测对上述(3)步骤的PCR扩增产物进行电泳分析；(5)、结果判断LSV、LMoV和CMV三种病毒呈阳性结果，分别对应电泳中长度为876bp、552bp、335bp的条带。