一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法

摘要

本发明公开了一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，将未知DNA模板与多条3’末端为3个或3个以上已知碱基的探针平行杂交并延伸标记的碱基，通过检测是否有标记物延伸，根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个(或以上)连续碱基的信息，拼接出待测DNA序列信息；包括重复进行的杂交、延伸和检测步骤。本发明方法在传统杂交测序法中加入延伸一步，能够解决假阳性及成本高的问题，实现高通量，低成本，高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。

主权项

1、一种反向杂交偶联延伸DNA测序方法，其特征在于DNA序列确定是通过3’末端为已知碱基的杂交引物平行地与待测DNA序列经过多次杂交、延伸、检测来实现，包括如下步骤：步骤1)3’末端为三个或三个以上已知碱基的杂交引物与固定的未知DNA模板在杂交液中加热，然后冷却退火进行杂交；步骤2)用洗液洗净杂交液后，标记单体在聚合酶的催化下，在杂交引物的3’末端延伸一个或多个碱基；通过芯片扫描仪读取延伸碱基的信息，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列；步骤3)用变性液将延伸碱基的杂交引物从未知DNA模板中洗脱，再将3’末端已知碱基序列不同的杂交引物按步骤1)与未知DNA模板杂交并进行步骤2)，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列；用不同的杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定；所述的杂交引物3’末端为三个或三个以上已知碱基；5’端带有7个或7个以上碱基，其中碱基为四种碱基T，A，G，C中不限定的任意一种，或者用通用碱基I代替；所述的标记单体，是指碱基单体A，G，C或T上包含可以直接或者间接检测的基团或者粒子，而且3’为双脱氧或被可切割基团所封闭。