应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖内切酶的方法

摘要

本发明公开了一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖内切酶的方法，属生物技术领域，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控葡聚糖内切酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达葡聚糖内切酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的葡聚糖内切酶有利于产物的纯化，解决应用天然产葡聚糖内切酶的菌株生产葡聚糖内切酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于葡聚糖内切酶的大规模生产。

主权项

1、一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖内切酶的方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在pGAP启动子的基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控葡聚糖内切酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化为毕赤酵母基因组；3)、根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；4)、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达葡聚糖内切酶，在发酵过程中用氨水维持pH在4～6；所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7 H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成：CuSO4·5H2O 1.5～2.5g/L，NaI·2H2O0.1～0.2g/L，MnSO4·H2O 2.5～3.5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1～0.3g/L，H3BO3 0.01～0.03g/L，CoCl2·6H2O 1.0～2.0g/L，ZnCl2 6.5～7.5g/L，Fe2(SO4)3·7H2O 20～25g/L，生物素0.1～0.3g/L，硫酸1～2ml/L。