修整的重组酶用于治疗逆转录病毒感染的用途

摘要

本发明涉及用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法，其中所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的逆转录病毒的原病毒DNA的LTR内的不对称靶位点重组，并且作为用于从宿主细胞的基因组中切除原病毒的工具有用。本发明进一步涉及最优化受试者的逆转录病毒感染的治疗的体外方法，以及修整的重组酶用于制备药物组合物用于减少受逆转录病毒感染的受试者中的病毒量的用途。

主权项

1.用于制备编码修整的重组酶的表达载体的方法，所述修整的重组酶使插入宿主细胞的基因组内的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括下述步骤(a)测定所述原病毒DNA的LTR序列，鉴定其中与重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列具有至少30％同源性的序列，其中所述同源序列由5-12个核苷酸的间隔区分开，并且其中与已知靶位点具有最高同源性的所述同源LTR序列代表不对称靶序列；(b)制备2种合成序列，其中所述第一种合成序列对应于步骤(a)与所述已知靶位点的左半位点同源的不对称靶序列的序列加上所述间隔区序列，且称为“半位点序列1”，且其中所述第二种合成序列对应于所述间隔区序列加上步骤(a)与右半位点同源的不对称靶序列的序列，且称为“半位点序列2”；(c)测定在步骤(b)的合成序列内偏离步骤(a)的已知同源靶位点的相应同源左半位点和右半位点序列的核苷酸；(d)基于步骤(b)的所述合成序列产生2种靶序列的第一个子集，其中所述第一个子集中的所述第一种靶序列包含由通过所述间隔区序列分开的步骤(a)的半位点序列1和半位点序列1′组成的反向重复，且其中所述第一个子集中的所述第二种靶序列包含由通过所述间隔区序列分开的半位点序列2′和步骤(b)的半位点序列2组成的反向重复，其中半位点序列1′和2′代表步骤(b)分别的半位点序列1和2的反向重复；(e)基于步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列产生靶序列的第二个子集，其中通过基于所选择的半位点序列构成反向重复，步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列的每个半位点序列连同分别的间隔区序列用于产生所述第二个子集的独立靶序列，从而使得所述间隔区序列使构成反向重复的2个序列分开，其中源于步骤(d)的所述第一个子集中的靶序列之一的2个半位点序列的序列在其合成过程中且在使用其用于产生得到完全靶序列的反向重复前改变，从而使得在所述左半位点序列中，偏离步骤(a)的已知靶位点的相应同源半位点序列的核苷酸部分由已知靶位点中发现的天然核苷酸替换，并且在所述右半位点序列中，偏离相应同源左半位点的其余核苷酸由已知靶位点中发现的天然核苷酸替换，从而使得合起来看在源于步骤(d)的所述第一个子集的一种靶序列的2个半位点序列中，可以发现所有偏离核苷酸，而所述半位点序列无一单独包含所有偏离核苷酸；(f)通过逐步重复步骤(e)的过程，从步骤(e)中获得的所述第二个子集中的靶序列开始产生靶序列的进一步子集，每次产生靶序列的一个新子集，直至在每个所产生的靶序列内构成反向重复的半位点序列包含偏离已知靶位点的相应同源半位点序列的1、2或3个核苷酸；(g)将分子定向进化应用于识别步骤(a)中所选择的已知同源靶位点的重组酶，其中使用步骤(f)中获得的最终子集的靶序列作为底物，所述靶序列包含偏离所述已知同源靶位点的相应同源半位点序列的1、2或3个核苷酸；(h)改组步骤(g)中进化的所述重组酶文库；(i)将分子定向进化应用于步骤(h)中获得的所述改组文库，其中使用根据步骤(f)的邻近更高子集的靶序列；(j)重复步骤(h)和(i)，直至通过分子定向进化取得至少一种重组酶，其对于步骤(a)的在逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性；(k)从所述文库中分离步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和(l)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体内。