发明名称 |
结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用 |
摘要 |
本发明公开了一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用。该表达载体的构建方法是:(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65基因的编码序列设计抗原基因Hsp65的1对引物P1和P2;(2)以质粒pEGFPHsp65为模板,用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65;(3)pCR-G载体的构建;(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建;(5)中间载体pCRGHsp65的克隆与构建;(6)目的载体pCAMBIA1300GHsp65的克隆与构建。本发明结核Hsp65抗原基因的表达载体可用于制备疫苗。 |
申请公布号 |
CN101613714A |
申请公布日期 |
2009.12.30 |
申请号 |
CN200810220697.8 |
申请日期 |
2008.12.31 |
申请人 |
暨南大学 |
发明人 |
李君武;胡建广 |
分类号 |
C12N15/82(2006.01)I;C12N15/31(2006.01)I;A61K39/04(2006.01)I;A61P31/06(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/82(2006.01)I |
代理机构 |
广州市华学知识产权代理有限公司 |
代理人 |
裘 晖;陈燕娴 |
主权项 |
1、一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65基因的编码序列设计抗原基因Hsp65的1对引物:上游引物序列为:P1 5′-TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTGCGT-3′,含BglII酶切位点和起始密码子ATG;下游引物序列为:P2 5′-CC TCTAGA TCAGAAATCCATGCCACCCATG-3′,含Xba I酶切位点和终止密码子CTA;(2)以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板,用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65;将扩增产物Hsp65直接插入pMD20-T载体,获得目的基因pMD20-THSP65;(3)pCR-G载体的构建:用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和<img file="A2008102206970002C1.GIF" wi="224" he="51" />经琼脂糖电泳分离,从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子glubulin-1,从<img file="A2008102206970002C2.GIF" wi="201" he="50" />酶切产物回收3.9kb的载体片段,将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pCR-G;(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建:用SacI和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18,经琼脂糖电泳分离,从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段,从pUC18酶切产物中回收2.6kb的载体片段,将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pUC18-nos;用XbaI和EcoRI酶切pUC18-nos,回收含有nos及多克隆位点的DNA片段,与经相同处理的质粒pCAMBIA-1300连接、转化获得重组质粒pCAMBIA-1300-nos;用XhoI酶切质粒pMDX1,回收560bp的bar基因片段,用XhoI切除质粒pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因,回收pCAMBIA-1300-nos并进行末端脱磷酸;将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒pCAMBIA1300-nos-bar;(5)中间载体pCRG Hsp65的克隆与构建:用BamHI和XbaI分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所得pMD20-THSP65,经琼脂糖电泳分离,纯化后进行连接、转化筛选获得重组载体pCRG Hsp65;(6)目的载体pCAMBIA1300GHsp65的克隆与构建:用HindIII和XbaI双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHsp65,得到globulin-1和Hsp65的联合片段,将HindIII和XbaI双酶切步骤(4)所得pCAMBIA1300--bar后的片段与上述联合片段连接、转化筛选获得目的载体pCAMBIA1300GHsp65。 |
地址 |
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