动物衣原体多重套式PCR检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及动物衣原体病的分型诊断试剂盒及其方法。本发明根据动物衣原体三种动物衣原体的ompA基因序列，设计了一对针对的上游及下游聚合酶链式反应寡聚核苷酸引物，可以扩增出所有动物衣原体的一条特异性片段，实现对动物衣原体属的所有衣原体进行有效的检测。在该引物的基础上，可以在临床核酸样本中单管同步扩增出三段长度大小不同的片段，在普通电泳中可以清晰分辨，从而实现对三种动物衣原体的同步检测。本发明利用套式多重PCR方法，单管同步检测猪衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体三种衣原体，从而降低了动物衣原体实验室动物衣原体疾病诊断的成本和工作量。特异性强、灵敏度高、可重复性高，且操作简便，没有繁杂的后处理。

主权项

1.一种猪衣原体多重套式PCR检测试剂盒，其特征是它包括Mix I PCR反应液管、Mix II PCR反应液管；阳性对照管、阴性对照管、样品裂解液A管、样品裂解液B管、提取液C管、异丙醇管、75％乙醇管、灭菌去离子水管；其中：(1)Mix I PCR反应管：管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO1的25mM的上游引物0.3uL；序列为SEQ ID NO2的25mM的下游引物0.3uL；10×PCR buffer缓冲液2.5uL；10mM dNTP Mix 0.5uL；25mM MgCl2 1.5uL；5U/uL Taq聚合酶0.25uL；灭菌双蒸水16.65uL；合计22uL，为单次反应的用量；(2)Mi x II PCR反应液管：管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO3的25mM的上游引物0.4uL；序列为SEQ ID NO4的25mM的下游引物0.2uL；序列为SEQ ID NO5的25mM的下游引物0.1uL；序列为SEQ ID NO6的25mM的下游引物0.2uL；10×PCR缓冲液2.5uL；10mM dNTP Mix 0.5uL；25mM MgCl2 2.0uL；5U/uL Taq聚合酶0.2uL；灭菌双蒸水15.9uL；合计22uL，为单次反应的用量；(3)阳性对照管：为猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体各自的ompA基因重组质粒，比例为1∶1∶1，2uL～20uL，其如下：猪源衣原体ompA基因重组质粒pMD19-csuH的DNA序列为SEQ ID NO7；鹦鹉热衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpsH的DNA序列为SEQ ID NO8；肺炎衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpnH的DNA序列为SEQ ID NO9；(4)阴性对照管：阴性对照为无衣原体感染猪的肺脏组织DNA样品，2uL-20uL；(5)试剂管：样品裂解液A管：1.5mM EDTA，0.8mM Tris，150mM NaCl，0.5％SDS，共计30mL；样品裂解液B管：25mg/mL蛋白酶K，200～500uL；提取液C管：碱性酚/氯仿/异戊醇混合液＝25/24/1(pH8.0)，12～30mL；(6)灭菌去离子水管：1～2mL。