膜蛋白分子相互作用的光学探测方法

摘要

一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：采用全内反射荧光成像系统探测细胞膜，在细胞膜的不同区域获取多组目标膜蛋白分子的图像，每组图像对应细胞膜的一个区域，每组图像包含多幅膜蛋白分子的序列图片；利用计算机进行数据处理，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，采用荧光强度与时间的关系曲线的淬灭次数判断图像中所含聚合的膜蛋白的分子数目；采用中心定位法确定聚合的膜蛋白中每个分子的位置，由此确定膜蛋白的分子之间的间距；重复第二步和第三步对每组图像逐一进行数据处理，绘制淬灭步骤统计图和分子间距统计图，以获得膜蛋白的聚合程度和分子间距的统计结果。

主权项

1、一种膜蛋白分子之间相互作用的光学探测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：第一步采用全内反射荧光成像系统探测细胞膜，在细胞膜的不同区域获取多组目标膜蛋白分子的图像，每组图像对应细胞膜的一个区域，每组图像包含多幅膜蛋白分子的序列图片，其具体步骤如下：①为了进行荧光探测，先构建目标膜蛋白与荧光蛋白的融合质粒，然后将其转染到细胞中，实现对待测样品的荧光标记；②将具有荧光标记的目标膜蛋白分子的活细胞置于全内反射荧光成像系统中，用高灵敏度CCD对细胞的不同区域拍摄多组膜蛋白分子的图像，每组图像对应一个区域，每组图像包含多幅分子序列图片；第二步利用计算机进行数据处理，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，采用荧光强度与时间的关系曲线的淬灭次数判断图像中所含膜蛋白分子的数目，该数据处理的过程如下：①对一组图像中的每一幅图片进行测量，得到荧光强度最大值或荧光强度平均值，绘制荧光强度与时间的关系曲线图，简称荧光强度图；②分析荧光强度图，该图中的荧光强度随时间的关系曲线呈现阶梯下降，荧光强度的第一次下降突变称为第一步淬灭，第二次下降突变称为第二步淬灭，第三次下降突变称为第三步淬灭，如此类推；该荧光强度图中，第一步淬灭之前的的区域称为a区间，第一步淬灭和第二步淬灭之间称为b区间，第三步淬灭与第二步淬灭之间称为c区间，……；根据荧光强度图的淬灭次数判断目标膜蛋白的聚合程度：一步淬灭说明没有发生蛋白的聚合，二步淬灭代表图片中含有两个分子，称为蛋白的二聚化，三步淬灭表明有三个分子，发生了蛋白的三聚化，以此类推；第三步采用中心定位法确定聚合的膜蛋白中每个分子的位置，由此确定膜蛋白的之间的间距，所述的中心定位法是一种数据处理方法，对两个分子膜蛋白的数据处理过程如下：①将某一组目标膜蛋白图像的处于b区间的某一单个图片读入计算机，即获得一10x10的二维强度矩阵，称为原矩阵I1，该矩阵I1包含有分子1的荧光强度分布；②对原矩阵I1做统计直方图，该图中荧光强度分界值设定为图像的背景值B；③对原矩阵I1的荧光强度减去背景值B并进行插值处理，形成100x100的新矩阵I1’；④以下列公式(1)为曲线方程，I1’中的矩阵元为数据点，利用最小二乘法对图像进行拟合，得到图像的中心点，即为分子1的位置坐标(x1，y1)，$N_{\mathrm{xy}}=N_{00}·\exp [-\frac{{(x-x_1)}^2+{\left({y-y}_1\right)}^2}{{2S}^2}]---\left(1\right)$式中：(x1，y1)即点物体的中心位置；Nxy，N00分别是像素(x，y)处和中心位置(x1，y1)处的成像强度值；S是点扩散函数的半高全宽；⑤将a区间的某一图片读入计算机，即获得一10x10的二维强度矩阵，称为原矩阵I2，该矩阵I2包含有分子1和分子2的荧光强度分布；⑥将矩阵I2减矩阵I1，得到分子2的荧光强度分布矩阵并进行插值处理，形成分子2的100x100荧光强度分布新矩阵I2’；⑦按上述步骤④进行数据处理，得到分子2的位置坐标(x2，y2)；⑧计算分子1和分子2之间的距离：d(2，1)x＝|x2-x1|；d(2，1)y＝|y2-y1|；对三分子膜蛋白的数据处理过程如下：①将某一组目标膜蛋白图像的处于c区间的某一单个图片读入计算机，获得一10x10的二维强度矩阵，称为原矩阵I1，该矩阵I1包含有分子1的荧光强度分布；②对原矩阵I1做统计直方图，该图中荧光强度分界值设定为图像的背景值B；③将原矩阵I1的荧光强度减去背景值B并进行插值处理，形成100x100的新矩阵I1’；④以下列公式(1)为曲线方程，I1’中的矩阵元为数据点，利用最小二乘法对图像进行拟合，得到图像的中心点即为分子1的位置坐标(x1，y1)，$N_{\mathrm{xy}}=N_{00}·\exp [-\frac{{(x-x_1)}^2+{\left({y-y}_1\right)}^2}{{2S}^2}]---\left(1\right)$式中：(x1，y1)即点物体的中心位置；Nxy，N00分别是像素(x，y)处和中心位置(x1，y1)处的成像强度值；S是点扩散函数的半高全宽；⑤将b区间的某一图片读入计算机，获得一10x10的二维强度矩阵，称为原矩阵I2，该矩阵I2包含有分子1和分子2的荧光强度分布；⑥将矩阵I2减矩阵I1，得到分子2的荧光强度分布矩阵并进行插值处理，形成分子2的100x100荧光强度分布新矩阵I2’；⑦按上述步骤④进行数据处理，得到分子2的位置坐标(x2，y2)；⑧将a区间的某一图片读入计算机，获得一10x10的二维强度矩阵，称为原矩阵I3，该矩阵I3包含有分子1、分子2和分子3的荧光强度分布；从原矩阵I3减去矩阵I2，得到分子3的荧光强度分布矩阵并进行插值处理，形成分子3的100x100荧光强度分布新矩阵I3’按上述步骤④进行数据处理，得到分子3的位置坐标(x3，y3)；⑨计算分子1、分子2和分子3之间的距离：分子1、分子2之间的距离：d(2，1)x＝|x2-x1|d(2，1)y＝|y2-y1|；分子1、分子3之间的距离：d(3，1)x＝|x3-x1|d(3，1)y＝|y3-y1|；分子2、分子3之间的距离：d(3，2)x＝|x3-x2|d(3，2)y＝|y3-y2|第四步重复第二步和第三步对每组图像逐一进行数据处理，绘制淬灭步骤统计图和分子间距统计图，获得膜蛋白的聚合程度和分子间距的统计结果。