猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法及其应用，其步骤是：克隆猪的NAGS基因，根据该基因序列设计并合成引物，将获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中；培养转化重组质粒的BL21到OD值为0.4；在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM，诱导；将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，加入溶菌酶裂解，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；使用Hitrap chealtingHP镍亲和层析柱纯化蛋白；用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体，用不完全福氏佐剂加强；得到相应的抗血清。本发明能检测不同发育阶段NAGS在哺乳仔猪体内的分布和表达活性的变化。

主权项

1、一种猪N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗体的制备方法，其特征是包括如下步骤：1)克隆猪的NAGS基因，根据该基因序列设计并合成引物：NAGSF：5′-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGACATGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3′；NAGSR：5′-CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3′，其中Sal1酶切位点5’G’TCGAC 3’，EcoR1酶切位点5’G’AATTC 3’，CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签，通过RT-PCR扩增猪NAGS基因的编码区序列，其全长为1107bp；2)将步骤1)获得的NAGS基因连接入pLM1载体中，并将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，筛选并得到如图1所示的重组原核表达质粒pLM1-NAGS；3)将步骤2)获得的表达全长猪N-乙酰谷氨酸合成酶的重组原核表达质粒pLM1-NAGS转化到大肠杆菌BL21中；4)培养步骤3)的大肠杆菌BL21，直到菌液OD值为0.4；5)在培养的大肠杆菌BL21中加入IPTG 0.2mM，诱导；6)将诱导后的菌体离心收集，用PBS重悬，加入溶菌酶裂解，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集上清；7)使用Hitrap chealting HP镍亲和层析柱纯化蛋白；8)用纯化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作为抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗体，用不完全福氏佐剂加强；9)测抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效价，取血，得到相应的抗血清。