基于光漂白的荧光共振能量效率的定量测量方法

摘要

本发明涉及荧光共振能量转移效率的测量方法，具体涉及一种基于光漂白的荧光共振能量效率的定量测量方法。本方法是通过激光共聚焦显微镜采集转染了供体－受体对的活细胞中受体光漂白前后供体通道和受体通道光漂白前后的平均荧光强度，来计算荧光共振能量效率。本方法可以有效解决传统的受体光漂白方法由于光漂白时间过长而导致对活细胞损伤较大的问题。运用本方法，通过漂白一小部分受体即可定量获FRET效率，从而定量监测活细胞中蛋白质之间的相互作用。由于本方法漂白时间短，仅为秒量级，可以极大的减少对活细胞的损伤。

主权项

1、一种基于光漂白的荧光共振能量效率的定量测量方法，包括以下具体步骤：(1)在活细胞中表达供体-受体对；(2)利用激光共聚焦扫描荧光显微镜对上述细胞进行多通道荧光成像和FRET受体光漂白；FRET检测时，使用氩离子激光器选择性的激光供体，选择合适的荧光探测通道分别用来收集供体和受体的荧光；光漂白时，采用氩离子激光器选择性地光漂白受体，采集受体光漂白前后供体通道和受体通道光漂白前后的平均荧光强度，得到供体通道增加的荧光强度为ΔI_D以及受体通道减少的荧光强度为ΔI_A；(3)计算荧光共振能量转移效率E：$E=\frac{\Delta I_D{\phi }_D{\phi }_A{C}_{D-\mathrm{CH}1}{C}_{A-\mathrm{CH}2}-(\Delta I_D+\Delta I_A){\phi }_D{\phi }_D{C}_{D-\mathrm{CH}1}{C}_{D-\mathrm{CH}2}}{(\Delta I_D+\Delta I_A)({\phi }_D{\phi }_A{C}_{D-\mathrm{CH}1}{C}_{A-\mathrm{CH}2}-{\phi }_D{\phi }_D{C}_{D-\mathrm{CH}1}{C}_{D-\mathrm{CH}2})}$其中，$C_{D-\mathrm{CH}1}={\int }_{{\lambda }_1}^{{\lambda }_2}\mathrm{Fil}1\left(\lambda \right)S{P}_d\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }/{\int }_0^{\infty }S{P}_d\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda };$$C_{A-\mathrm{CH}2}={\int }_{{\lambda }_3}^{{\lambda }_4}\mathrm{Fil}2\left(\lambda \right)S{P}_a\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }/{\int }_0^{\infty }S{P}_a\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda };$$C_{D-\mathrm{CH}2}={\int }_{{\lambda }_3}^{{\lambda }_4}\mathrm{Fil}2\left(\lambda \right)S{P}_d\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda }/{\int }_0^{\infty }S{P}_d\left(\lambda \right)\mathrm{d\lambda };$Fil1(λ)和Fil2(λ)分别是供体和受体通道的滤光片的参数方程；SP_d(λ)和SP_a(λ)是归一化的供体和受体的荧光发射谱；φ_D和φ_A分别是供体和受体的量子产额。