可二次验证碱基信息的DNA测序方法

摘要

本发明可二次验证碱基信息的DNA测序方法涉及的是一种能够原位清除延伸标记物，能够二次验证同一个碱基位置的信息，逐个碱基鉴定未知DNA序列。该技术过程如下：1)3′端硫代修饰的测序引物与被固定的待测DNA序列进行杂交；2)加入第一次延伸反应溶液，延伸四种荧光标记的核苷酸单体，通过检测得到碱基信息；3)将2)中延伸上的核苷酸单体用酶进行切割清除；4)加入第二次延伸反应溶液，延伸荧光标记的可脱保护的硫代核苷酸单体，通过检测再次得到碱基信息；5)用化学试剂去除4)中延伸上的硫代核苷酸单体上的可脱保护基团和荧光基团；循环上述2)、3)、4)和5)所进行的过程，直到确定待测DNA中的碱基序列信息。

主权项

1、一种可二次验证碱基信息的DNA测序方法，其特征在于DNA序列上一个碱基的信息的确定是通过两次延伸测序步骤来实现的，该DNA测序过程如下：步骤1)3′端碱基硫代修饰的测序引物与被固定的待测DNA序列进行杂交；步骤2)加入第一次延伸反应溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四种用荧光标记的核苷酸单体A、T、C、G和四种正常的核苷酸单体A、T、C、G，用荧光标记的核苷酸单体和同种类正常核苷酸单体之间的分子数比例为1∶50～100，通过在上述测序引物上延伸四种核苷酸单体A、T、C、G中的一种、并通过荧光检测到第一次延伸的碱基信息；步骤3)将步骤2)中延伸上的用荧光标记核苷酸单体通过生物酶切割方法进行清除；步骤4)加入第二次延伸反应溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四种用荧光标记的可脱保护的硫代核苷酸单体A、T、C、G和四种未标记荧光的可脱保护的硫代核苷酸单体A、T、C、G，用荧光标记的可脱保护的硫代核苷酸单体和同种类未标记荧光的可脱保护的硫代核苷酸单体之间的分子数比例为1∶50～100，通过在测序引物上延伸可脱保护的硫代核苷酸单体A、T、C、G中的一种，并通过荧光检测到第二次延伸的同一位置的碱基信息；步骤5)用化学试剂去除上述步骤4)中延伸上的用荧光标记的可脱保护的硫代核苷酸单体上的可脱保护基团，同时去除该硫代核苷酸单体上的荧光基团；循环上述步骤2)、3)、4)和5)所进行的过程，直到确定待测DNA中的碱基序列信息。