| 主权项 |
1.一种用于个体氨基糖苷类药物致聋致残筛查的方法，其特征在于，其方法为：步骤1，用采样拭在一个被测者口腔中左右两腮至少需要各上下刮40-60次，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提步骤1被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，共抽提2个样本，采用电泳凝胶成像法对基因组DNA浓度和纯度作检测，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3.基因分型将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，1个反应孔检测961、1095位点，另一个1个反应孔检测1494、1555位点，每一个反应孔分别测2个位点的基因分型采用荧光定量PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点进行基因型进行确定：3-1，反应体系配置在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中QPCR MIX即PCR定量试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；检测961、1095位点的线粒体DNA 611-1411正向和反向引物：正向引物：CTCCTCAAAGCAATACACTG反向引物：TGCTAAATCCACCTTCGAGC检测1494、1555位点的线粒体DNA 1245-2007正向和反向引物：正向引物：CGATCAACCTAACCACCTCT反向引物：TGGACAACCAGCTATCACCA3-2，PCR反应条件将2个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热95℃15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；3-3，将2个反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测：a.1％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bp DNA marker即DNA标记物：6ulc.PCR产物：4ul+电泳缓冲液r：1uld.电泳电压：120ve.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图7个样本PCR后产物，25ng/ul的电泳结果图，目的条带800bp左右；7个样本PCR后产物的电泳结果图为：3-4，纯化终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON10.125ul、PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，设备ABI 3730测序仪；3-5-1，从-20度冰箱中取出PCR纯化产物、测序试剂MIX、测序缓冲液seq buffer、1uM引物，测序引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC；3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、MIX用量、PCR反应条件；3-5-3，取一块反应板，表上模板名、引物名、日期；3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用两个反应孔，其中一个加入第一组引物，检测961、1095位点的线粒体DNA 611-1411正向和反向引物，另一个加入另一组引物，检测1494、1555位点的线粒体DNA 1245-2007正向和反向引物；3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的测序试剂mix3.1、1.4ul的测序缓冲液sequence buffer、2ul的测序引物1uM primer、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；3-5-8，再在每孔加入100％乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；3-5-10，轻轻倒去上清液，将96孔板导致离心，达800转即停，再在每孔加30ul70％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，轻轻倒去上清液，将96孔板导致离心，达800转即停，将残余酒精风干，室温放置20分钟；3-5-11，每孔加入8ul的95％甲酰胺，5％ddH2O；3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用网上免费下载软件Chromas查阅测序检测结果：每一个被测者4个位置分别有4个结果；通过5000-10000个被测者的检测，归纳出：961位置实验有3种结果，即正常结果、T缺失突变结果和C插入突变结果；1095位置实验有2种结果，即正常结果和突变结果；1494位置实验有2种结果，即正常结果和突变结果；1555位置实验有2种结果，即正常结果和突变结果；步骤4，结果分析根据每一个被测者的4个位置的结果，得出检测分析为：1，未检出突变：您的检测结果中未发现携带以上位点的突变；2.检出突变：强烈建议您在医生指导下禁止使用氨基糖苷类药物。 |
