胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体及其用途

摘要

一种胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对AFP基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA1、pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA2和pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA3，能高效的特异性的抑制AFP基因表达，可用于制备治疗分泌AFP的胃癌的基因药物。

主权项

1.靶向甲胎蛋白AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonor Vector为载体，针对AFP基因编码区上、中、下游的三段序列，在可特异表达AFP的人胃腺癌细胞株FU97中发挥RNA干扰作用，这三段AFP特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于与AFP相关的胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择AFP基因编码区的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下：①AFP寡核苷酸序列1：正义链5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’②AFP寡核苷酸序列2：正义链5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’③AFP寡核苷酸序列3：正义链5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’(2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector连接、转化、扩增及质粒的提取首先用TE缓冲液重悬步骤(1)合成的具有AFP寡核苷酸序列1、AFP寡核苷酸序列2和AFP寡核苷酸序列3的AFP寡核苷酸干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃ 30秒，72℃ 2分钟，37℃ 2分钟，25℃ 2分钟完成退火；然后将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，再用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA；(3)质粒的鉴定质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector质粒中。