基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，特别是指一种基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法。其中动物免疫、分离脾细胞、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存、乙肝疫苗的标记、单克隆抗体的矩阵点样、芯片的杂交等工艺步骤，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题。此芯片可直接应用于一线基因工程药物生产企业进行检测和质控研究，在基因工程药物研究领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标，检查药物的毒性或副作用及进行药物产品的定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。

主权项

1、基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤：(1)动物免疫：将高纯度的人基因工程药物乙肝疫苗1-10ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人基因工程药物乙肝疫苗，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合：将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞：待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选：选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多厂家、多批次的基因工程药物乙肝疫苗进行特异性和效价筛选。(6)单克隆抗体纯化保存：选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。(7)CY3标记基因工程药物乙肝疫苗：用CyDye DIGE Fluor，Cy3 minimaldye系统采用标准方法将基因工程药物乙肝疫苗标记上CY3。(8)基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体微阵列点样：一张芯片点100个点，从第一个点至第100个点每一个点的含量以10pg/ml递增，检测线性范围0.01～10ng/ml。(9)与其它基因工程药物进行特异性筛选。