土壤蛋白质提取及胞内蛋白质的分离方法

摘要

一种高效的土壤蛋白质提取方法是把土壤加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液混匀后置4℃，摇床振荡过夜。振荡液用粗滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂(D101)，取过柱液过0.22μm微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液；滤膜上细胞经洗涤、破碎、离心分离和真空干燥获得干粉，干粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。胞外蛋白质母液经离心、分离和真空干燥获胞外土壤蛋白质干粉；胞内蛋白质干粉经裂解在10％聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳即可清楚分离，该方法具有高分离效率，所提微生物的得率为37.5％，高于传统方法0.1-1％的得率，建立了一种简易的操作流程，提高了得率，SDS-PAGE分辨率和质谱鉴定效果好。

主权项

1、一种高效的土壤蛋白质提取方法，包括样品前处理、蛋白的提取，其特征是：样品前处理：称取样品土壤65g于锥形瓶，加入预冷的土壤蛋白质提取缓冲液150ml，混匀后置4℃，摇床振荡过夜；振荡液用滤纸于布氏漏斗真空抽滤，取抽滤液过大孔树脂(D101)，取过柱液过0.22μm微孔滤膜，滤液为胞外蛋白质母液，滤膜上做进一步胞内蛋白质提取；土壤蛋白质提取缓冲液配制：0.82g磷酸二氢钾+0.16g磷酸氢二钾，定容至100ml，向其中加入8ml0.5M，pH8.0EDTA；胞外蛋白质的提取：取胞外蛋白质母液，加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4—5h，30000rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4℃超声波下洗涤10min，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞外土壤蛋白质；胞内蛋白质的提取：取上述0.22μm微孔滤膜于烧杯中，加入20ml的预冷的上壤蛋白质提取缓冲液，于超声波仪器4℃超声洗涤10分钟，弃滤膜，溶液倒入50ml离心管中，离心管于细胞破碎仪中细胞破碎，细胞破碎完成后，向离心管中加入等体积的预冷的丙酮溶液，混匀后静置沉淀4—5h，30000rpm，4℃离心30min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的无水乙醇于4℃超声波下洗涤10min，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用预冷的乙醚洗涤，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用真空干燥机干燥，干粉即为胞内土壤蛋白质沉淀物。