羟喜树碱的微生物转化制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羟喜树碱的微生物转化制备方法，本发明利用无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)对悬浮培养的喜树细胞进行生物转化，获得转化后的喜树细胞培养物经过原料粉碎、回流提取、析晶、硅胶柱层析、结晶等分离和精制，从而得到羟喜树碱纯品。本发明是利用微生物对悬浮培养的喜树细胞进行生物转化获取具有抗肿瘤活性的植物次生代谢产物羟喜树碱，其含量达到了细胞干重的0.4％(g/g)；建立了获得羟喜树碱高产的新途径，符合可持续发展的要求；分离羟喜树碱的方法简便易行，产品的纯度高，有很好的发展前景。

主权项

1. 羟喜树碱的微生物转化制备方法，其特征在于，以喜树的幼茎为外植体，将在固体培养基上诱导、并继代的喜树愈伤组织转入液体培养基中，进行喜树细胞悬浮培养，再接种微生物培养转化；然后经提取、析晶、柱层析、结晶等方法分离纯化经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱，步骤如下：一、喜树细胞培养系的建立：A、喜树愈伤组织的诱导和继代培养：喜树愈伤组织的诱导和继代培养是在光照培养箱中进行的，光照8-10小时/天，培养温度为20～35℃，培养3～10天，喜树愈伤组织每隔3～15天继代一次，继代3～10次。作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了1.0～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l2，4-二氯苯氧乙酸，凝固剂为琼脂6g/l，pH为5.5～6.5；B、喜树细胞培养悬浮系建立：将A步培养好的喜树愈伤组织转入通气量为0.1～0.5l/min的气升式内环流反应器中培养，温度为20～35℃，喜树细胞培养每隔3～15天继代一次；进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加1.0～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l2，4-二氯苯氧乙酸，pH为5.5～6.5；喜树细胞培养周期为5～25天；二、微生物对悬浮培养喜树细胞的生物转化：A. 喜树细胞的悬浮培养及微生物的接种：无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)的接种：于喜树细胞培养期的第5～25天接种1％～2％的无毒黄曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距1～100小时后接种1％～2％的根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)；B. 微生物的培养转化条件：初始PH值为5. 5～6.5，温度为25～35℃，在接种根霉T-34菌株(Rhizopus sp.)后再培养转化1～240小时；C、喜树细胞培养物的收获：喜树细胞培养物收获后，用清水冲洗干净，减压抽滤去除残液后置于恒温干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，备用；三、羟喜树碱的分离与纯化：A. 经微生物转化后的喜树细胞培养物中羟喜树碱的提取：以乙醇为提取液，采用连续回流提取，在80～95℃水浴中，提取喜树细胞培养物粉末内的羟喜树碱，得到含有羟喜树碱的提取液；B. 浓缩、析晶：提取液经减压浓缩至1/15体积，趁热过滤，静置放冷，析晶后过滤，晶体备用；滤液真空挥干溶剂，以少量热乙醇溶解，静置放冷，析晶；合并晶体以热乙醇重结晶，结晶体用甲醇∶三氯甲烷＝1∶5(V/V)的溶剂溶解，得到含有羟喜树碱的溶液；C. 硅胶柱对结晶溶液的再分离：硅胶柱分别以三氯甲烷、甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100(V/V)、甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)依次梯度洗脱，收集甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)洗脱液，得到含有羟喜树碱的洗脱液；D. 对洗脱液的再结晶：减压回收溶剂至干，分别以无水乙醇和甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)两种溶液结晶，其中甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)溶液结晶得到羟喜树碱纯品。