家蚕滞育品种的转基因方法

摘要

一种家蚕滞育种的转基因蚕的制作方法利用亲代所处环境条件与子代蚕卵的滞育性的关系，利用在转基因操作的前一个世代对滞育性家蚕品种进行环境条件的控制以改变该品种在转基因操作当代的滞育性，随后对所得的非滞育性的蚕卵进行蚕卵胚胎显微注射并利用荧光蛋白标记进行筛选，制作转基因家蚕该方法巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍，并有效地克服了现有转基因方法的缺陷，将为家蚕转基因技术在功能基因研究和生物反应器开发等实用研究中的大规模应用奠定坚实的技术基础。

主权项

1、一种家蚕滞育品种的转基因方法，其特征在于依次通过下列步骤实现：(1)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15℃恒温、相对湿度75％、黑暗的环境中催青至孵化；(2)逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束；(3)将四龄起蚕转移至27℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟；(4)将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中，待其化蛹完毕后削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中进行种茧保护；(5)待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；(6)以收集蚕卵时间开始记时，于收集后2h-4h用显微注射仪将10-15nL、总浓度400ng/uL的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔；(7)将注射完成的蚕卵在35-37％的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25℃、相对湿度85％以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的G1代蚕卵，G1代蚕卵经即时浸酸处理后于胚胎发育第六天在荧光显微镜下扫描获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。上述步骤中，h表示小时，min表示分钟。