一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法

摘要

一种燕麦蛋白ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽的制备方法，属于燕麦精深加工技术领域。本发明以燕麦麸为原料，经粉碎、酶法预处理、碱法提取、离心分离、上清液等电点沉淀、沉淀加水均质后再添加碱性蛋白酶水解、离心后上清液经离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到四种新的燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D，并利用串联质谱对其结构进行了鉴定，并测定其半抑制率IC₅₀值。本发明方法设计科学合理，对于实现燕麦资源的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。

主权项

1、一种燕麦蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征是以燕麦麸为原料，经粉碎，加水和复合多糖酶Viscozyme L进行酶法预处理后，调节提取液至碱性环境提取燕麦蛋白，离心分离，上清液等电点沉淀，所得沉淀加水均质后，再添加碱性蛋白酶进行水解反应，离心分离，所得上清液经色谱分离技术，得到高活性的燕麦蛋白ACE抑制肽，工艺为：(1)原料粉碎：原料燕麦麸进行粉碎，过40目筛网；(2)酶法预处理：粉碎后的燕麦麸按1∶10的质量比例加水，调节pH值至4.5～5.0、温度40～45℃后，加入复合多糖酶Viscozyme L，加酶量300FBG/100g燕麦麸，酶解时间为2h；(3)碱性环境提取燕麦蛋白：酶法预处理后调节提取液的pH至9.5，50℃下搅拌浸提30分钟；(4)离心分离：将反应料液经3000转/分钟、离心分离20分钟，取上清液；(5)上清液等电点沉淀：上清液用HCl调pH值至4.5后，将所得悬浊液经3000转/分钟、离心分离20分钟，得沉淀；(6)沉淀加水均质：按1∶20的比例在沉淀中加水混匀并均质；(7)加蛋白酶水解：均质后的溶液调pH值7.5，温度60℃，按酶底比E/S＝1.33％的比例添加碱性蛋白酶Alcalase3.0T作用90分钟；酶解结束后升温至90℃、10分钟灭酶；(8)离心分离：酶解液冷却至室温后3000转/分钟，离心分离30分钟，取上清液；(9)纯化：离心后上清液采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离纯化出四种单一的燕麦蛋白ACE抑制肽组分；离子交换色谱分离：所得上清液直接上离子交换色谱进行第一步分离，色谱条件为：分离介质DEAE Sepharose Fast Flow；起始缓冲液0.02mol/L、pH4.0HAc-NaAc缓冲液；含0～1mol/L的NaCl缓冲溶液线性梯度洗脱；凝胶过滤色谱分离：收集离子交换色谱分离所得高ACE抑制活性组分上凝胶过滤色谱进行第二步分离，色谱条件为：分离介质Sephadex G-25；蒸馏水洗脱；反相高效液相色谱分离：收集凝胶过滤色谱分离所得高ACE抑制活性组分上反相液相色谱进行第三步分离：色谱条件为：Lichrospher C18反相柱；洗脱条件，0～10min，0～20％b；10～20min，20％～35％b；20～30min，35％～100％b；30～34min，100％～0％b；34～40min，100％a；a液为：5％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余为水；b液为：80％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余为水；经三步纯化工艺后，共得到四种单一的高ACE抑制活性肽组分，分别为燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D；其半抑制率IC50值分别为10.6μM，31.6μM、113.8μM和77.3μM；(10)肽片段结构鉴定对纯化出的燕麦蛋白ACE抑制肽A、B、C和D四种肽段利用MALDI—TOF/TOF进行结构鉴定，氨基酸序列分别为AYKPIRSK、APRGF、GGDIIRPG和EGGYR。