筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法

摘要

本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，提供了筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法。本方法根据HIV核心蛋白氨基酸序列相对保守，具有活化B细胞的一级结构表位和活化杀伤T细胞作用的原理，构建了重组表达质粒pJ38gag/IFNα-2b，采用脂质体转染法，以野生型痘苗病毒为介导转基因，使pJ38gag/IFNα-2b与野生型痘苗病毒发生同源重组，利用HA特性，筛选纯化出vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒株，使gag/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒在真核细胞表达。小鼠实验表明gag/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒共表达产物能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫，表达的蛋白产物可以作为抗原进行免疫预防。本项发明为研究艾滋病病毒结构蛋白的抗原性，提供了一个获得艾滋病病毒核心蛋白的重要途径。

主权项

1. 筛选含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：①pJ38gag/IFNα-2b基因重组与鉴定在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-70℃超低温冰箱冻存，用于转化质粒，采用CaCl2转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101中，在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位置后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检测260nm和280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置-20℃冰箱中保存，备用于连接反应，DNA目的基因片断与载体的回收；分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法；酶切DNA片段的3’凹端补平与线性质粒DNA的5′端去磷分别采用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶分别置室温、37℃、55℃、75℃反应，将3’凹端补平与5′端去磷的线性质粒DNA用0.5weiss单位的T4 DNA连接酶置16℃水浴过夜或25℃ 1h；进行连接反应；重组子的筛选和鉴定采用酶切法；挑选酶切结果与理论预计值相同者进一步用两种以上内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者， 即为目的重组表达质粒pJ38gag/IFNα-2b；②pJ38gag/IFNα-2b在真核细胞中表达与鉴定真核细胞表达是以野生型痘苗病毒为介导转基因，采用脂质体转染细胞法，使pJ38gag/IFNα-2b在细胞内与野生型痘苗病毒发生同源重组：具体操作是分别在35mm平皿中培养的RK、BHK21以及Cos-7细胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI为0.1的野生型病毒，于37℃、5％CO2反应1h后与包裹脂质体的质粒进行共转染，同时设未感染病毒的正常细胞和未加转染试剂的痘苗病毒感染细胞为对照；培养48h后，以血凝素基因为报告基因，筛选纯化含目的基因pJ38gag/IFNα-2b的重组痘苗病毒；利用HA特性，筛选纯化出vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒株，经过3～4代的纯化直至稳定表达HA-斑为止，48h后收毒；以细胞培养法扩增重组痘苗病毒，以间接免疫荧光分析、Dot-ELISA、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白印迹方法鉴定pJ38gag/IFNα-2b目的基因在真核细胞中的表达产物，确定其分子量；③pJ38gag/IFNα-2b表达产物的免疫原性和免疫反应性将筛选纯化的vJ38gag/IFNα-2b重组痘苗病毒接种于体外培养的单层细胞，培养约30h左右，收取感染细胞，测定病毒PFU值，调整病毒的滴度使其达到108PFU，用弗氏佐剂制备样品，采用足垫和腹腔两种免疫途径免疫小鼠，加强免疫3次，饲养60天后，眼球取血，无菌制备脾淋巴细胞，采用HIV-1间接ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清HIV抗体，在DG5030型酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的光密度值(OD490)，流式细胞仪FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学分析。