柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联方法及其产物

摘要

本发明公开了一种柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，是通过离子交换层析将IFNs类似物(IFNs Analogs，IFNs-A)上的赖氨酸epsilon氨基“封闭”而实现PEG-ALD与IFNs-A N-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-IFNs-A产物。本发明还进一步公开了所述聚乙二醇化重组人干扰素类似物蛋白在制备治疗乙型或丙型病毒性肝炎、多发性硬化症、风湿或类风湿性关节炎、恶性肿瘤、毛白血病和艾滋病卡波氏瘤药物中的应用。

主权项

1. 一种柱层析PEG与干扰素类似物蛋白氮端定点偶联的方法，步骤包括：选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将IFNs-A原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG∶IFNs-A的反应量比为5～50mol∶1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量范围为26～40kDa的mPEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算：(1)X＝5～50×m×MWPEG/MWIFNs-A式中：X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的IFNs-A蛋白含量，MWPEG和MWIFNs-A分别为PEG和IFNs-A的分子量；再按下列公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量：(2)NaBH3CN加入量＝10×MW还原剂×X/MWPEG式中：MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.01M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得两个洗脱峰，即P1和P2，其中P1的峰面积占总峰面积的72±1％，为单修饰的PEG-IFNs-A，即聚乙二醇与IFNs-A蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；其中：上述IFNs-A为通过融合技术将柔性连接链(GlyGlyGlyGlySer)t与IFNs的N-末端融合而获得的融合蛋白：(GlyGlyGlyGlySer)t-N-IFNs；其中t为1～10，IFNs为重组人干扰素alfa或beta，其氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列公式；上述mPEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，为mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。