一种有效提高基因定点转换（突变/修复）的新方法

摘要

本发明涉及一种细胞内基因操作技术，利用DNA合成阻滞剂——胸苷(thymidine)可以将传统单链寡核苷酸介导的基因定点转换(修复/突变)的效率显著提高。目前应用本发明所获得的最佳结果是将效率提高到原先传统方法的约10倍水平。本发明通过胸苷降低复制叉移动速度，使靶基因在复制叉部位长时间以单链形式存在，为单链寡核苷酸与靶序列发生互补配对进而完成靶位点的转换(修复/突变)人为地创造了条件。本发明所获得的结果可以有效提高基因定点转换技术在各个领域的应用性，包括动植物遗传育种、病毒微生物的功能转化，人类点突变遗传病的基因治疗，以及在功能基因组学研究中对单核苷酸多态性的研究方法等。本发明同时提供了一种构建用于基因定点转换研究的报告系统的方法，以及由此方法获得的一株细胞系，该系统在检测、评估基因定点转换效果方面具有优越性。

主权项

1. 一种体外提高细胞内基因定点转换的方法，包括：针对靶位点设计合成转换用寡核苷酸分子；将寡核苷酸分子与转染试剂混合，形成转染复合物；使生长期S期的细胞与有效抑制DNA合成浓度的S期DNA合成抑制剂接触，使染色体DNA的复制叉处于阻滞状态，其中所述S期DNA合成抑制剂是浓度为1mM至4mM的胸苷；将转染复合物与所述的染色体DNA的复制叉被阻滞的细胞共孵育；进入细胞的单链寡核苷酸通过同源互补与靶序列相互作用，完成靶位点的定点转换。