| 主权项 |
1、牛精子克隆胚胎的方法，其步骤包括：(1)将采集回的牛卵巢用磷酸缓冲液洗后将卵丘-卵母细胞复合体抽出，置于成熟培养液中进行体外培养，使所述的卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期，用透明质酸酶对卵丘-卵母细胞复合体脱颗粒细胞处理；(2)先对步骤(1)的卵母细胞的细胞核染色，置于卵母细胞去核液中，再对细胞核进行荧光定位，准确吸取所述的细胞核，得到去核的牛卵母细胞；(3)采集同一头优秀种公牛的精液，或采集同一品种的不同个体的两头优秀种公牛的精液，或采集不同品种的两头优秀种公牛的精液，或购买性控优秀种公牛的商用精液，将所述的种公牛精液置液氮罐中贮存备用；(4)将所述的种公牛精液在37℃下解冻，用精子获能液使所述的精子获能，置于卵母细胞注射液中备用；(5)用显微操作针一次性将步骤(4)所述的两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；(6)将步骤(5)构建好的精子重构胚用激活培养基-1和激活培养基-2进行体外人工激活，使重构胚融合，然后，将激活后的精子重构胚置于胚胎培养液中培养；其中：步骤(1)的成熟培养液组分及配比如下：以TCM-199商品培养基为基本培养基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mmol，丙酮酸钠0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黄体素0.1IU/mL、雌激素1μg/mL、表皮生长因子100ng/mL，调pH至7.0-7.2；步骤(1)的磷酸缓冲液组分及配比如下：氯化钠8.0g/L+氯化钾0.2g/L，磷酸氢钠1.15g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，调pH至7.0-7.2；步骤(2)的卵母细胞去核液：基础液为成熟培养液，添加5μg/mL细胞松弛素B，以重量/体积计的10％聚乙烯吡咯烷酮；步骤(4)的精子获能液：BO基础液+6mg/mL牛血清白蛋白，5mM咖啡因，60ug/mL肝素；步骤(5)的卵母细胞注射液：基础液为步骤(1)的成熟培养液，添加按重量/体积计的10％聚乙烯吡咯烷酮；步骤(6)的激活培养基-1和激活培养基-2的组分及配比如下：激活培养基-1：基础液为成熟培养液附加离子霉素5μmol/L，调pH至7.0-7.2；激活培养基-2：基础液为成熟培养液附加二甲基氨基嘌呤2mmol/L，调pH至7.0-7.2；步骤(6)的胚胎培养液组分及配比如下：氯化钠107.63mmol/L，氯化钾7.16mmol/L，磷酸二氢钾1.19mmol/L，硫酸镁1.51mmol/L，青霉素钠0.012g/L，硫酸链霉素50μg/L，乳酸钠5.35mmol/L，碳酸氢钠25.00mmol/L，丙酮酸钠7.27mmol/L，氯化钙1.78mmol/L，肌醇2.77mmol/L，酚红10.0μg/mL，枸杞酸钠0.34mmol/L，必需氨基酸30.0μl/ml，非必需氨基酸10μl/mL，L-谷氨酰胺0.20mmol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，调pH至7.0-7.2；其中BO基础液配方 mg/100mlNaCl 655.0；KCl 30.0；CaCl2.2H2O 33.0；MgCl2.6H2O 10.6；NaH2PO4.2H2O 12.98；NaHCO3 310.8；葡萄糖 275.5；丙酮酸钠 16.5；青霉素 100IU/ml；链霉素 100IU/ml补充六蒸水至100ml。 |
