PCR反应中的非竞争性内对照系统

摘要

本发明涉及聚合酶链反应体系中内对照分子的定量方法和内对照分子的构建方法、以及基于其得到的量和/或内对照分子的核酸扩增方法和相应检测试剂盒。另外，本发明还涉及二步法PCR扩增方法和内对照分子或试剂盒的应用等。上述方法用以提高检测灵敏度和/或兼顾检测灵敏度和表征假阴性结果的可靠性，并可以灵活适应PCR扩增体系和检测方式的改变。

主权项

1、一种PCR定性检测样品中靶核酸的方法中所用的内对照分子的优化量的确定方法，其包括如下步骤：(1)以相同的扩增条件，分别进行k个相同的阴性PCR扩增，所述阴性PCR扩增体系中内对照分子的加入量为No，k≥10；该阴性PCR扩增体系包含靶核酸引物对、内对照分子和内对照引物对，其中不存在靶核酸；(2)分别检测步骤(1)的阴性PCR扩增后是否扩增出内对照分子，未检测到内对照分子扩增的阴性PCR扩增的个数为t；若t＝0或者t＝k，则调整No，重新从步骤(1)开始进行；若t＝0，提高内对照分子的量；若t＝k，降低内对照分子的量；(3)根据公式(I)计算临界量Nc$\mathrm{Nc}=\frac{\mathrm{No}}{-\ln (t/k)}$(I)；和(4)根据Nc确定内对照分子的优化量，内对照分子的优化量介于3.0×Nc至9.2×Nc。