一种抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法

摘要

一种抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，本发明利用基因工程的方法提供了一种绵羊抗菌肽的编码基因、利用重组DNA技术构建真核表达载体，构建、在于重组表达载体转化宿主工程菌GS115，构建表达工程菌、进行甲醇诱导表达，表达产物经凝胶过滤色谱、反相液相色谱得到重组绵羊生殖道抗菌肽。本发明制取的抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革兰氏阳性、阴性和真菌的生长，且具有分离提纯工艺快速、高效，回收率高等特点，可广泛用于兽药、防腐剂、医药产品等领域。

主权项

1、一种抗白色念珠菌抗菌肽的基因工程制取方法，其特征在于由以下方法来实现；绵羊生殖道抗菌肽的核酸序列如序列表<210>1所示，绵羊生殖道抗菌肽的氨基酸序列如序列表<210>2所示，天然抗菌肽序列人工合成酵母偏爱密码子序列如序列表<210>3所示，上游引物序列如序列表<210>4所示，下游引物序列如序列表<210>5所示，下游引物序列如序列表<210>6所示，上游引物序列如序列表<210>7所示，下游引物序列如序列表<210>8所示，引物浓度为0. 0009mmol/L，绵羊生殖道抗菌肽cDNA克隆；首先，利用3～5μg总RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行巢式PCR(巢式聚合酶链反应)，第一次PCR扩增反应体系为25μL，其中含：2～2.5μL10×Ex Taq Buffer、1U TaKaRa Ex TaqTM、上游引物如序列表<210>4和下游引物如序列表<210>5，各0.5～1μL、2～5μL cDNA模板、1×cDNA dilution buffer3～4μL、14～16μL灭菌的三蒸水，扩增条件为94～95℃2～3min变性后进入循环，循环参数为：94℃30～45S，54～56℃30～45S，72℃1～2min，30～35个循环后71～73℃延伸7～10min，第二次PCR以第一次PCR产物为模板，引物用上游引物如序列表L PCR产物用浓度为1.5～2％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性和阴性对照与以上描述的相同；采用回收试剂盒回收PCR扩增目的产物250bp，纯化后，直接与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选，提取质粒，PCR鉴定后，选取3个阳性克隆测序，测序结果显示，得到的产物为目的基因；绵羊抗菌肽密码子优化及真核表达载体的构件：第一步：绵羊抗菌肽密码子优化，并克隆于PUC57-T载体上，密码子序列如序列表<210>3：第二步：重组表达载体的构建；将PUC57-T-ORTAP40与pPIC3.5K质粒分别用EcoRI、BamHI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化、回收，得到目的片段，将其中的pPIC3.5K大片段与DNA片段于16～18℃T4DNA连接酶连接，转化感受态细胞，转化子经蓝白斑筛选，PCR和双酶切鉴定后，测定序列，验证其读码框的正确性；绵羊生殖道抗菌肽的重组酵母转化子鉴定与诱导表达：重组酵母转化子的表型筛选与PCR鉴定：将重组质粒用电转仪器，在1996～2000v时电转入工程菌GS115中，并用遗传酶素G418进行筛选，将高浓度抗生素下的酵母菌落分别对应在MM和MD两平板上，同时在28～30℃培养2～3天，在MM平板上生长缓慢，而在MD平板上正常生长的菌落，为甲醇利用缓慢型，在MM和MD平板上生长均正常的菌落，为甲醇利用野生型(Mut+)；重组酵母转化子的PCR鉴定：首先提取酵母基因组DNA，即在湿重2～5g的酵母菌中加入2～6单位的融细胞酶，28～32℃培养10～30min，然后置放于零下70～80℃30～40min，最后用玻璃珠破碎，破碎后用10000～12000r/min离心，2～5min，取上清，上清内含有酵母基因组，以酵母基因组DNA为模板，上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，进行PCR扩增，反应体系50ul，其中含10×PCRBuffer4-6ul、体积浓度为25mmol/LMgCl23～5ul、体积浓度为2～2.5mmol/LdNTP1.5～2.5ul、上游引物如序列表<210>7和下游引物如序列表<210>8，各1.5～2.5ul、Taq酶0.25～0.35ul、模板3～6ul、ddH2O27～30ul；PCR反应条件94～95℃2～3min，变性后进入循环，循环参数为：92-95℃0.5～1min，54～56℃0.5～1min，71-73℃1～2min，共30～35个循环，最后在72℃延伸7～10min；挑取甲醇利用野生型(Mut+)转化子单菌落接种于25～100mlBMGY培养基28～30℃200～250r/min振荡培养至OD280～600达到2.0～6.0时，0～10℃5000～10000r/min离心收集菌体，将菌体用100～200mlBMMY培养基重悬，使OD280-600达到1.0，27～30℃200～300r/min继续振荡培养，每隔18～26h补加一次甲醇至终体积浓度为0.5％v/v，同时每隔22-26h取一次培养液，经0～10℃5000～10000r/min离心5～10min，收集菌体沉淀，用玻璃珠法裂解菌体，结果表明：所表达的目的产物具有很强的抗菌活性；重组抗菌肽初级分离；用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将48～53.0g交联葡聚糖凝胶G-50，溶解于480.0～530.0mL去离子水中澎胀20～26h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ1cm×15～100cm柱，先用0.15～0.25N氢氧化钠清洗液冲洗2～4h，再用浓度为0.1～0.05mol/L，pH值为5～7乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以9000～12000r/min离心10～20min，取上清上样，洗脱流速18～20mL/h，收集目的峰，整个洗脱过程在0～10℃环境中进行，用吸光值200～300nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.01～0.05％乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性，进行活性实验；重组抗菌肽精分离：用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.01～0.05％乙酸洗脱液中，在0～10℃时以9000～12000r/min离心10～20min，取上清上样于反相高效液相色谱柱，柱长为0.2～0.5cm×20～100cm，用含浓度为0.08～0.11％三氟乙酸的水和含浓度为0.08～0.11％三氟乙酸的乙腈按990～999∶1～10的体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值200～300nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥，测定蛋白浓度、检测抗菌活性。