间氨基苯硼酸亲和层析法纯化的糖基化蚓激酶及纯化方法

摘要

本方法采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从蚯蚓的匀浆液中分离纯化出单一的具有纤溶酶活力的糖基化组分。亲和层析过程中采用琼脂糖凝胶作为填料，间氨基苯硼酸作为配基，顺式单糖作为特异性洗脱液，并通过透析或分子筛等方法脱盐，得到糖基化组分；干燥储存。该组分经过SDS-PAGE检测为单一成分，N-末端序列为N-Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Pro-Asp-Ile-，是一种新的蛋白质。生色底物测活实验表明它具有较高的纤溶蛋白酶活性。此方法简洁方便，成本低，适用于规模化生产。

主权项

1、一种采用间氨基苯硼酸亲和层析分离纯化糖基化蚓激酶的方法，包括以下步骤：1)选取琼脂糖做填料；2)采用间氨基苯硼酸作为亲和层析树脂的配基：将间氨基苯硼酸溶解在0.2M NaHCO3缓冲液或pH＝8.5，0.15MNaCl中，浓度为10-100g/L，然后与活化后的琼脂糖填料按照1∶5-5∶1的比例混合，搅拌0.5-2小时，在温度为4℃-40℃下，使配基连接到琼脂糖填料上；3)装柱，用终浓度分别为0.01-0.05M的天门冬酰氨，0.01-0.05M氯化镁及0.01-0.05％的叠氮化钠的混合液平衡，平衡液的pH范围是6.0-14；4)上样：样品是经过通常自溶、匀浆、盐析方法得到的蚯蚓粗提物，上样时样品的浓度为0.5-5mg/mL，体积为柱体积的1/10—1/3；上样缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH5.0-14，浓度为5-50mM；5)非特异性洗脱采用终浓度分别为0.001-0.01M的Tris-HCl，0.001-0.005M的天门冬酰氨，0.05-0.5M氯化镁及0.01-0.05％的叠氮化钠四者混合液作洗脱液，非特异性洗脱液pH范围6—12；特异性洗脱液采用终浓度分别是0.05-0.5M的Tris-HCl，0.001-0.01M的天门冬酰氨，0.1-1.0M顺式糖及0.01-0.05％叠氮化钠的混合液，特异性洗脱液的pH范围5.0—10，收集特异性洗脱下来的糖化蛋白。